天麻素脂質體的制備及其結構表征

覃引，邱樹毅，張振，周劍麗，胡女丹

(1.貴州理工學院 制藥工程學院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

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天麻素脂質體的制備及其結構表征

覃引1，邱樹毅2，張振1，周劍麗1，胡女丹1

(1.貴州理工學院 制藥工程學院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

目的 研究天麻素脂質體的最佳制備工藝，并表征其結構。方法 采用薄膜—超聲法制備。以包封率為指標，卵磷脂與膽固醇之間的質量比、油水相的體積比和超聲時間為考察因素，采用L9(34)正交試驗法優化制備工藝；顯微鏡下觀察脂質體的形態、粒徑大小和分布，并測定其包封率和穩定性。結果 回歸方程式為Y=239.75X+0.0207(n=5),R2=0.9996，在0.002～0.010 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。最佳工藝為：卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1、水油相的體積比為3:1、超聲時間控制為60 min；脂質體呈現類球形或橢圓形，形態規則、大小均勻；平均包封率為60.65%，平均粒徑分布為327 nm，穩定性良好。結論 優選后的制備工藝穩定，所需設備簡單，包封率較高，粒徑較均勻，可適用于包埋水溶性藥物。

天麻素；脂質體；包封率；制備工藝；正交試驗

天麻GastrodiaelataBl.為蘭科植物天麻的干燥塊莖，是我國名貴的中藥材之一，天麻素(gastrodine)是其主要成分[1]。現代藥理學研究表明天麻素具有增加中央及外周動脈血管順應性,降低外周血管阻力,增加心腦血管血流量,產生溫和降壓作用,而且對心肌細胞、腦組織均有保護作用,同時具有鎮靜、催眠、鎮痛、增強免疫等作用，臨床上廣泛用于治療心腦血管、微循環系統疾病，療效顯著，且無明顯不良反應[2]。目前常用制劑有天麻素注射液、天麻素片、天麻素膠囊。但一般口服劑型的生物利用度不高，采用脂質體當做藥物載體能有效提升患者胃腸道吸收能力，改善原本藥物的釋放性質[3]。本研究將天麻素制成天麻素脂質體，對其制備工藝進行了研究，確定了最佳配方，并測其包封率、穩定性、粒度、形狀等質量指標，旨在提高療效，為天麻素的新劑型開發和臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 天麻素對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110807)；天麻(購自貴州省藥材公司)；大豆卵磷脂(購自北京雙旋微生物培養基制品廠，批號：041129)； 膽固醇(購自海藍季科技發展有限公司，批號：051120)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH6.8)，嚴格按照2010年版《中國藥典》相關標準進行配制；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 脂質體的制備：采用薄膜—超聲法制備脂質體，稱取大豆相應劑量的卵磷脂和膽固醇，按照一定的比例倒入三角瓶容器內并加入15 mL氯仿溶解，氯仿經過蒸發后，瓶壁內形成一層脂膜，對脂膜給予干燥、去除氯仿味操作，加入15 mL的乙醚進行溶解處理，并在恒溫振蕩器加入 5 mL PBS溶液振蕩至均勻狀態，隨后使用超聲儀器制成乳(W/O型)，靜置0.5 h，使用旋轉蒸發儀去除乳液有機溶劑，此時容器內壁出現凝膠，依次實施蒸發處理使得凝膠脫落，添加50 mL PBS溶液，獲取脂質體的混懸液，冰放入冰箱內存儲。

1.3.2 脂質體包封率的測定

① 繪制標準曲線：精密稱定在80 ℃環境下干燥至恒重狀態的10 mg天麻素標準品，置于100 mL的容量瓶并甲醇稀釋并定容至刻度，輕輕混勻，得0.1 mg/mL的天麻素貯備液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL貯備液，置于10 mL容量瓶內，用甲醇定容形成梯度溶液，以甲醇作為對照，于220 nm處分別測量其吸光度。

② 精密度試驗：選取0.006 mg/mL天麻素對照品溶液，以甲醇作為對照，于220 nm處測量其吸光度(n=5)。

③專屬性試驗分別選用空白、破乳脂質體和天麻素標準品在同一環境下利用光譜進行掃描。

④ 脂質體的包封率：采用移液槍吸取合理劑量的脂質體混懸液添加至1.5 mL塑料離心管內，利用離心機進行10 min的冷凍離心操作，同時吸取清液0.5 mL放入50 mL容器內，采用PBS溶液進行稀釋至刻度，在220 nm處測量其吸光度，采用外標法算得游離藥物量W游。按下式計算包封率：

包封率(En)%=(W總-W游))/ W游×100%

1.3.3 正交試驗優化脂質體制備工藝：根據預實驗得出的結論可以看出，卵磷脂與膽固醇之間的質量比(A)、油水相的體積比(B)和超聲時間(C)等方面均會影響脂質體的形成及變化。本次實驗通過質量比(A)、體積比(B)、超聲時間(C)3項指標進行研究，運用正交實驗方法，各個因素分別抽取3個水平，采用不同因素的包封率(En %)作為評價指標，運用L9(34)正交表統計分析，獲得包封天麻素最佳工藝組合。因素水平表見表1。

第三，要完善農業用水計量設施。目前我們的計量設施不完善，僅占1/3左右。目前水費的收取有兩種形式，一種是按方計算，有計量設施的，比如1 m3水交多少錢。最明顯的是井灌區，都是搞IC卡，農民付了多少水費，插進去就灌多長時間，這種方法的收取是百分之百，而且科學合理。但是非井灌區很多都是按畝收費，一畝地核定多少稻谷、核定多少玉米，折算成貨幣來收取，實際用了多少水也不清楚，所以下一步要加大量水設施的建設。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels table

1.3.4 驗證試驗：根據優化的工藝組合制備3批天麻素脂質體，根據“1.3.2”項下④計算獲得包封率。

1.3.5 觀察脂質體形態并測量粒徑

① 把制備完成的脂質體混懸液進行多倍的稀釋，吸取一定的液體滴入載玻片，蓋好蓋玻片，放在顯微鏡下認真觀察并拍照。

② 通過負染法把脂質體進行稀釋操作，給予1 %磷鎢酸實施染色，放入銅網上進行制樣，借助透射電鏡認真觀察并拍照。

③ 脂質體采用水當做分散介質，通過激光粒度分析儀測量其粒徑分布情況及其平均大小。

1.3.6 穩定性試驗

① 計算脂質體的滲透率

測定制備當日脂質體的包封率，隨之將脂質體放入冰箱內 4 ℃ 存儲。分別在10、20、30、40、50 d時測量脂質體的包封率，滲透率公式為：

滲透率(Pe)% =(當日所測包封率-定期測量包封率)/當日測得的包封率×100%。

② 粒徑變化

按“①”項下的方法處理樣品，再按“1.3.5”項下的③方法測量脂質體平均粒徑變化情況。

2 結果

2.1 標準曲線的繪制 以吸光度為縱坐標(Y),濃度為橫坐標(X)，繪制天麻素標準曲線，回歸方程式為：Y=239.75X+0.0207,R2=0.9996(n=5)。由計算結果可知，在0.002～0.010 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。見圖1。

圖1 天麻素的標準曲線Fig.1 Standard curve of gastrodine

2.2 精密度試驗結果 獲取該脂質體的吸光度值RSD為0.41%,表明本試驗所用儀器具有良好的精密度。

2.3 專屬性試驗結果 天麻素標準溶液、天麻素脂質體和空白脂質體，3者在相同波長處，吸光度無干擾，表明方法的專屬性較強。見圖2。

圖2 標準樣品(a)、天麻素脂質體(b)和空白脂質體(c)的紫外圖譜Fig.2 Ultraviolet spectrum of standard sample (a)，gastrodine liposome (b) and black liposome(c)

2.4 正交試驗優化最佳工藝參數 各因素對脂質體包封率的影響大小次序為C > B > A，最佳配方為C3B2A3，即：卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1、水油相的體積比為3:1、超聲時間控制為60 min。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗L9(34)結果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal experiment design

表3 方差分析表Tab 3 Analysis of orthogonal experiment design variance

F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

2.5 驗證試驗 3批天麻素脂質體平均包封率是60.65%，計算的RSD為2.31 %。驗證試驗結果表明按照最佳制備配方完成的各批脂質體之間的包封率更為接近，重現性良好，表明使用的制備和測量方法可行性高。

2.6 天麻素脂質體的形態

2.6.1 脂質體的顯微形態：制備的脂質體呈現類球形或橢圓形，形態規則，脂質體大小均勻，見圖3，圖4。

圖3 顯微鏡下天麻素脂質體的形態(×400)A:染色脂質體；B：未染色脂質體Fig.3 Morphology of gastrodine liposome under microscope (×400)A:dyed liposome;B:un-dyed liposome

圖4 電鏡下的天麻素脂質體形態(×400)Fig.4 Microscope of gastrodine liposome under transmission electron microscope(×400)

2.6.2 測定脂質體粒徑大小及分布情況：天麻素脂質體的平均粒徑為327 nm， 粒徑分布見圖5， 圖5表明脂質體粒徑分布處于均勻狀態。

圖5 脂質體的粒徑分布Fig.5 Particle diameters distribution of liposmes

2.7 滲透率測定結果 任意選擇制備完成的脂質體樣品(7號樣品) 按照“1.3.3”項下③的方法對其滲透率進行計算，見表6，由此可知，脂質體放置50 d后再次計算其滲透率為0.687%，RSD為1.89%。認真觀察脂質體外觀情況，脂質體隨著貯存時間的增加，粒徑大小并無明顯變化，并未發現明顯的團聚和沉淀情況，見圖4。pH值也并未改變。表示該脂質體具有緩釋的效果并具有良好的穩定性，能夠長期貯存。

3 討論

本研究借助薄膜-超聲法對天麻素脂質體進行制備，這種制備方法操作比較簡單，粒徑分布良好，成為制備脂質體的主要方法之一。正交試驗的方差分析結果表明所選因素對包封率的測定無顯著影響，因此不需要再進行多重比較分析，原因可能因實驗存在誤差且自由度比較小(僅為2)，導致試驗的靈敏度下降，在一定程度上掩蓋考察因素的顯著性[4]。

對于包封率的測定，本文采用了“高速離心+UV檢測”的方法，結果表明精密度良好，可信度高。除此之外，包封率的測定還有“透析”[5]、“電泳”[6]、“凝膠層析”[7]、超濾[8]等方法，但相比本文采用的方法，操作較繁瑣，耗時長。多種因素會影響脂質體的包封率[9-11]，除去制備所用工藝外，選用物質的分子量、pH值等都會對其有一定的影響，但上述因素還有待深入研究。

對天麻素脂質體進行制備的過程中，加入相應劑量的卵磷脂能出現雙分子層的作用，添加膽固醇能促使脂質體形成雙層膜，降低膜流動情況及其滲透率[12-13]。通過分析其因素可知，添加的膽固醇劑量并非越大效果越好，如果加入大量的膽固醇可能導致其與脂膜發生反應，促使脂膜間的藥物與磷脂的功能有所減弱，一定程度上可以降低脂質體的包封率，通過本試驗結果得出卵磷脂與膽固醇比值為2:1時，脂質體的效果最好。

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(編校：王冬梅)

Preparation and structure characterization of gastrodine liposomes

QIN Yin1, QIU Shu-yi2, ZHANG Zhen1, ZHOU Jian-li1, HU Nv-dan1

(1.School of Pharmaceutical Engineering, Guizhou Institute of Technology, Guiyang 550003, China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Bio-pharmacy, Guiyang 550003, China)

ObjectiveTo study the optimum preparation process of gastrodin liposome, characterization its structure.MethodsPerpared gastrodin liposome with film-ultrasonic method.The entrapment efficiency as index, quality between lecithin and cholesterol ratio, oil-water phase volume ratio and ultrasonic time as factors by L9(34) orthogonal test to optimize the preparation process.Observed the liposome morphology, particle size and distribution under the microscope, and determined the entrapment efficiency and stability.ResultsRegression equation wasY=239.75+0.0207X(n=5),R2=0.9996, 0.002 to 0.010 mg/mL had a good linear relationship.The optimum of preparation process: lecithin and cholesterol quality ratio was 4:1, water and oil phase volume ratio of 3:1, ultrasonic time control for 60 min; Liposomes showed spherical or oval shape, regular shape, uniform size.The average entrapment efficiency was 60.65%, the average particle size distribution at 327 nm, and it had good stability.ConclusionThe preparation of gastrodine liposome has advantages of simple, higher entrapment efficiency and even particle size.The method can be used for embedded water-soluble medicine.

gastrodine; liposome; entrapment efficiency; preparation process; orthogonal test

貴州理工學院科研基金(XJ2K20131204)

覃 引，女，碩士，講師，研究方向：藥物制劑，E-mail：qinyin0510@126.com。

R282.71

A

1005-1678(2015)05-0029-04