高血壓病肝火亢盛證型代謝組學(xué)的初步研究

寧 澄,王廣基,阿基業(yè),郝海平,陳曉虎,范群麗

高血壓病肝火亢盛證型代謝組學(xué)的初步研究

寧 澄1,王廣基2,阿基業(yè)2,郝海平2,陳曉虎1,范群麗1

目的初步探討高血壓病肝火亢盛證型患者的代謝組學(xué)變化,并確定其相關(guān)生物標(biāo)志物群,初步闡明高血壓病肝火亢盛證型的代謝組學(xué)內(nèi)涵。方法選取2008年8月—2008年12月在江蘇省中醫(yī)院就診的原發(fā)性高血壓中醫(yī)辨證為肝火亢盛證型患者24例,同時選取同期進(jìn)行體檢的健康人群21名,抽取受試者空腹12 h靜脈血、留取受試者晨尿。經(jīng)樣品前處理后,采用氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)技術(shù)對高血壓病肝火亢盛證型患者與健康人群的血清、尿液進(jìn)行全譜代謝組學(xué)分析,并進(jìn)一步采用主成分分析(PCA)進(jìn)行主成分因子負(fù)荷矩陣分析,并作變量散點圖,尋找高血壓病肝火亢盛證型相關(guān)的生物標(biāo)志物群。結(jié)果高血壓病肝火亢盛證型組與健康人群組血清和尿液的代謝譜圖均有改變,兩組血清代謝譜圖差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高血壓病肝火亢盛證型組與健康人群組血清和尿液的代謝產(chǎn)物中均存在發(fā)生顯著變化的化合物,并且兩組血清中的3-羥基丁酸和葡萄糖,以及尿液中的甘氨酸和磷酸差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論高血壓病肝火亢盛證型患者與健康人群代謝譜之間存在差異,而且可從代謝組學(xué)分析中找出特異的標(biāo)志性代謝物,闡釋中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì)。代謝組學(xué)是一種有良好發(fā)展前景的中醫(yī)證候?qū)W研究方法。

高血壓病;代謝組學(xué);肝火亢盛;中醫(yī)證型

高血壓病是以體循環(huán)動脈壓升高、周圍小動脈阻力增高,同時伴有不同程度代謝障礙為主要表現(xiàn)的臨床綜合征,是一種危害性極大的疾病。在我國高血壓病治療仍然面臨著知曉率低、治療率低、控制率低的問題。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計,目前我國高血壓病人數(shù)已達(dá)1.6億之多。高血壓屬中醫(yī)“頭痛”“眩暈”“風(fēng)眩”的范疇,主要以頭痛、失眠、煩躁易怒、乏力為常見癥狀,晚期因心、腦、腎等臟器出現(xiàn)不同程度的器質(zhì)性損害而出現(xiàn)相應(yīng)的各種臨床癥狀,甚至導(dǎo)致患者殘疾或死亡。高血壓病的病因很多,中醫(yī)認(rèn)為情志失調(diào)、飲食不節(jié)、先天稟賦不足或氣血精虧損,均可致陰陽臟腑平衡失調(diào)而發(fā)為本病。肝火亢盛證是高血壓病中的常見證型,也是中醫(yī)肝病的臨床常見證型之一,是某些疾病發(fā)展到一定階段所出現(xiàn)的病因、病理、病位、病勢的綜合表現(xiàn)。

20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的代謝組學(xué)(Metabolomics或Metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的又一門新興的組學(xué)技術(shù),是系統(tǒng)生物學(xué)研究不可或缺的重要基礎(chǔ)學(xué)科之一,通過系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,揭示機體生命活動代謝本質(zhì)的科學(xué),具有整體動態(tài)、綜合與分析等方法學(xué)特點,與中醫(yī)的系統(tǒng)整體觀相近。本研究初步探討高血壓病肝火亢盛證型患者的代謝組學(xué)變化,并確定其相關(guān)生物標(biāo)志物群,初步闡明高血壓病肝火亢盛證型的代謝組學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年8月—2008年12月在江蘇省中醫(yī)院心內(nèi)科門診就診的原發(fā)性高血壓患者84例,其中肝火亢盛證型患者24例;選擇在體檢中心檢查的健康人群21名作為健康對照組。高血壓病肝火亢盛證型組和健康對照組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例入選標(biāo)準(zhǔn) 符合原發(fā)性高血壓西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]和中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],男性患者,年齡35歲～ 65歲,1周內(nèi)不同日2次以上測血壓,血壓達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn),未用藥物,或曾服用藥物(包括降壓藥物)但已停用1周。

1.3 采樣及處理方法 抽取受試者空腹12 h靜脈血,分離取血清,保存在-80℃冰箱,留取受試者晨尿,統(tǒng)一送至中國藥科大學(xué)藥代動力學(xué)重點實驗室進(jìn)行代謝組學(xué)測定。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品處理 血清、尿液樣品分別采用4倍和6倍量甲醇沉淀,混勻0℃靜置2 h,超速離心、烘干后進(jìn)行肟化和衍生化處理。

1.4.2 儀器設(shè)置 色譜條件選擇,質(zhì)譜(mass spectrometer,MS)檢測參數(shù)設(shè)置需根據(jù)實際測定樣品過程中相應(yīng)優(yōu)化調(diào)整。

1.4.3 代謝組譜圖處理 首先對譜峰進(jìn)行基線校正,峰匹配,并用內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行峰面積和保留時間校正后,對譜圖按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分段積分,如氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(gas chromatography/time of flight-mass spectrometer,GC/TOF-MS)選擇400個峰,將積分值和保留指數(shù)導(dǎo)入Excel文件,運用SIMCA-P軟件進(jìn)行化學(xué)信息學(xué)計算,如進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),獲得模式判別和分類結(jié)果。

1.4.4 生物標(biāo)記物的獲得及確證 生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)與確證是代謝組學(xué)研究的目標(biāo)和重要突破口之一。通過上述分析所獲得的代謝指紋圖譜,經(jīng)譜圖預(yù)處理并積分后,對積分值進(jìn)行多元統(tǒng)計分析,根據(jù)各樣本的主成分得分作圖,可判別組間差異并對組別進(jìn)行分類;進(jìn)一步用分析進(jìn)行主成分因子負(fù)荷矩陣分析,并作變量散點圖(Loading plot),從圖中可發(fā)現(xiàn)顯著升高或降低的變量,這些變量的組合即為表征病變的“生物標(biāo)記物群”,但此時獲得的僅為相關(guān)峰信息如相應(yīng)的保留指數(shù)和荷質(zhì)比等。需進(jìn)一步根據(jù)這些信息,進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測,查詢相關(guān)數(shù)據(jù)庫如NIST譜庫以及實驗室自建的化合物信息庫,必要時運用標(biāo)準(zhǔn)品對比進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。連續(xù)性變量指標(biāo)做自然對數(shù)轉(zhuǎn)換以改善參數(shù)分布的正態(tài)性,組間比較采用t檢驗及方差分析,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高血壓病肝火亢盛證型組與健康對照組血清代謝物數(shù)據(jù)處理結(jié)果偏最小二乘法-判別分析(partial least aquares discriminate analysis,PLS-DA)法得分圖(散點越靠近說明樣品間差異越小,反之,距離越遠(yuǎn),差異越大)顯示:健康對照組與高血壓病肝火亢盛證型組的樣品能明顯的被區(qū)分開來,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖1。

圖1 兩組血清代謝物代謝譜圖

模型所對應(yīng)的這張圖上可以找出在兩組間有顯著差異的峰/化合物/變量(紅色方框),上述在兩組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量,右側(cè)正值在健康對照組中濃度高,左側(cè)負(fù)值在高血壓病肝火亢盛證型組濃度高。詳見圖2。

圖2 兩組血清代謝物主成分因子負(fù)荷矩陣分析

高血壓病肝火亢盛證型組與健康對照組相比,血清標(biāo)本發(fā)生顯著性變化的化合物總計有61個,其中被鑒定出的化合物包括:3-羥基丁酸、肌酸酐、尿素、β-D吡喃型葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、葡萄糖。兩組3-羥基丁酸和葡萄糖比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 高血壓病肝火亢盛證型組與健康對照組尿液代謝物數(shù)據(jù)處理結(jié)果PLS-DA法得分圖顯示:健康對照組與高血壓病肝火亢盛證型組尿液代謝物差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖3。

圖3 兩組尿液代謝物代謝譜圖

高血壓病肝火亢盛證型組與健康對照組相比,尿液標(biāo)本發(fā)生顯著性變化的化合物總計有24個,其中被鑒定出的化合物包括:肌醇、反丁烯二酸、奎尼酸、十二甲基五硅氧烷、甘氨酸和磷酸。兩組甘氨酸和磷酸比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

血液、尿液是一種含有許多內(nèi)源性化合物的復(fù)雜體液,因此利用高通量、高靈敏的分析手段結(jié)合模式識別可以區(qū)分疾病模型和正常個體,找出區(qū)分兩者的內(nèi)源性化合物,建立疾病經(jīng)典指標(biāo)與代謝組學(xué)中生物標(biāo)志物的關(guān)系,從而為研究發(fā)病機制提供依據(jù)。本研究表明在高血壓病肝火亢盛證組血清GC-MS代謝譜圖的Loading plot中3-羥基丁酸和葡萄糖明顯高于健康對照組,而高血壓病肝火亢盛證組尿液GC-MS代謝譜圖的Loading plot中甘氨酸明顯低于健康對照組,而磷酸明顯高于健康對照組。

近年來多項實驗與研究均支持高血糖可能為高血壓的一個獨立危險因素。其機制可能有以下幾個方面:①高血糖增加糖在近曲小管的重吸收,而伴隨鈉重吸收,增加體內(nèi)鈉容量(常為10%左右)和細(xì)胞外液容量,使血容量增加致血壓升高[3]。②血糖與電解質(zhì)相似,能進(jìn)入動脈、小動脈壁,引起細(xì)胞內(nèi)水潴留和增加血管反應(yīng)性,導(dǎo)致周圍血管阻力的增加[4]。③交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性可能是血壓與血糖相關(guān)的一個環(huán)節(jié)。高血糖時,細(xì)胞內(nèi)被灌注的葡萄糖可增加血管平滑肌對交感神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)性,使血壓升高[5,6]。以上均提示高血糖可能為高血壓的獨立危險因素,但其確切機制有待探討。

同時葡萄糖代謝受損(IGM)與心血管疾病危險性高有關(guān)聯(lián)。外周和中心動脈僵硬化增加可能代表葡萄糖耐量狀態(tài)導(dǎo)致心血管疾病的病理渠道。外周動脈僵硬性隨著葡萄糖耐量狀態(tài)惡化而增加,而此種趨勢對中心動脈僵硬性尚不清楚。葡萄糖耐量惡化與中心和外周動脈僵硬性增加有關(guān)聯(lián),從而可以部分地說明IGM與心血管危險性增加相關(guān)聯(lián)的原因。

甘氨酸即α-氨基乙酸,屬于不帶電荷的極性氨基酸,是一種非必需氨基酸,含一個氨基和一個羧基,是化學(xué)結(jié)構(gòu)最簡單的氨基酸,也是人體內(nèi)一種非必需氨基酸,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),在其他組織內(nèi)常被認(rèn)為功能不明顯、僅為合成其他氨基酸提供氮源。然而,近年的研究發(fā)現(xiàn),它還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)等作用。動物實驗表明,它在缺血再灌注損傷、休克、酒精性肝炎、肝硬化、關(guān)節(jié)炎、急性壞死性胰腺炎、腫瘤和藥物中毒等多種疾病中發(fā)揮有效的治療作用。甘氨酸通過直接作用靶細(xì)胞或間接調(diào)節(jié)炎癥因子起到細(xì)胞保護(hù)作用。

目前,關(guān)于磷酸及3-羥基丁酸的代謝與高血壓發(fā)病的關(guān)系尚未有明確研究及結(jié)果,但對于磷酸代謝及合成產(chǎn)物已經(jīng)開始展開研究。三磷酸肌醇(inositol 1, 4,5-triphosphate,IP3)是近年來逐漸被關(guān)注的一種細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子,在許多病理狀態(tài)下會發(fā)生IP3的改變。Arima等研究證實了IP3有可能通過損傷內(nèi)皮而與高血壓的發(fā)生與惡化有關(guān)。

中醫(yī)證候之間存在著代謝產(chǎn)物的不同,這種不同是基于不同證候存在著不同物質(zhì)代謝或其代謝網(wǎng)絡(luò)的改變。中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究可從代謝組學(xué)研究中找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物,用生物信息學(xué)方法分析生物標(biāo)志物的功能,來確定“證相關(guān)代謝譜群”。而代謝組學(xué)技術(shù)可以從一個生物樣品中檢測出數(shù)百種低相對分子質(zhì)量的化合物。這些化合物的相互作用可以和細(xì)胞的生物化學(xué)和生理學(xué)相聯(lián)系。目前應(yīng)用代謝組學(xué)方法研究高血壓的報道還不多,但隨著代謝組學(xué)研究的深入及其廣泛應(yīng)用,進(jìn)一步將蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)的研究有機結(jié)合,代謝組學(xué)必將在揭示高血壓病特異的標(biāo)志性代謝物,闡釋中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì),乃至進(jìn)一步闡明高血壓的病因機制和發(fā)生發(fā)展規(guī)律,早期診斷預(yù)防及個體化治療中發(fā)揮更大的作用。

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R544.1 R255.3

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.005

1672-1349(2015)06-0717-04

2014-10-16)

(本文編輯郭懷印)

江蘇省自然科學(xué)基金項目(No.BK2008493)

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(南京210029),E-mail: ningchengnj@126.com;2.中國藥科大學(xué)藥代動力學(xué)重點實驗室