應用IHA與競爭ELISA方法檢測豬瘟免疫抗體的比較與分析

湯海平　林永樂　林躍華　王藝娟（福建省漳州市動物疫病預防控制中心，福建漳州363000）

豬病防控Swine Disease Prevention and Control

應用IHA與競爭ELISA方法檢測豬瘟免疫抗體的比較與分析

湯海平林永樂林躍華王藝娟
（福建省漳州市動物疫病預防控制中心，福建漳州363000）

摘要：通過對300份豬血清樣品應用正向間接血凝試驗（IHA）與酶聯免疫吸附試驗（競爭ELISA）方法進行豬瘟免疫抗體檢測。采用IHA方法，以抗體效價≥25為合格標準時，其抗體合格率為95.3%；采用競爭ELISA方法，以阻斷率≤50%為陽性標準時，其抗體陽性率為93.6%，兩種檢測方法總體一致符合率93.0%，經X2檢驗，兩者差異不顯著，說明IHA方法和競爭ELISA方法皆可用于檢測豬瘟免疫抗體水平。

關鍵詞：豬瘟；免疫抗體；IHA；ELISA

豬瘟是國家要求強制免疫的動物疫病之一，疫苗免疫效果關系著豬群是否被保護而不受感染，因此，選擇正確的檢測方法對豬瘟免疫抗體效價進行檢測并科學評估較為重要。基層獸醫實驗室通常采用正向間接血凝試驗(IHA)檢測豬瘟免疫抗體，而上層獸醫實驗室則多數采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。為了獲得IHA和ELISA兩種檢測方法之間存在的關系，減少因檢測方法不同而出現的結果差異，筆者對300份豬血清樣品進行豬瘟免疫抗體水平的平行對比檢測，并詳細比較這兩種常規檢測結果，為正確合理地評價豬瘟疫苗免疫抗體水平提供參考。

1　材料與方法

1.1免疫疫苗種類

豬瘟傳代細胞苗，哈藥集團生物疫苗有限公司生產，批號：201402～201405。

1.2被檢血清

樣品來源于福建省漳州市各縣（市、區）抽檢的2014年秋季強制免疫過2次豬瘟疫苗的豬血液樣品300份，實驗室分離血清，置4℃冰箱保存待檢。

1.3診斷試劑

豬瘟間接血凝抗體檢測試劑盒（配套有抗原、陽性血清、陰性血清及稀釋液）購自中國農業農科院蘭州獸醫研究所診斷中心，批號：2014112105；豬瘟抗體ELISA檢測診斷試劑盒購自法國ID.VET公司，LOT：626。

1.4儀器設備

德國Brand單道、多道微量移液器；奧地利TECAN公司酶標儀，型號為Infinite M200PRO。

1.5檢測方法與判定標準

IHA試驗，依據《豬瘟診斷技術規程》（NY/SY 156-2000）和中國農業農科院蘭州獸醫研究所提供的使用說明書進行操作。判定標準：其免疫抗體≥1∶16（第4孔），呈現“++”凝集為免疫合格；按《2014年福建省動物疫病監測與流行病學調查計劃》的通知文件要求，免疫個體在免疫21天后，抗體阻斷ELISA方法和抗體間接ELISA方法檢測抗體陽性即判定為合格，抗體正向間接血凝試驗抗體效價≥25判定為合格，以文件要求作為此次判定標準。

ELISA試驗按ID.vet公司的競爭ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測波長為450 nm，判定標準：S/N（%）=ODsp/ODnc×100，S/N≤50%為陽性、50%＜S/N≤60%為可疑、S/N＞60%為陰性，本試驗以S/N≤50%為陽性、合格，以S/N＞50%為陰性、不合格。

2　檢測結果

2.1豬瘟抗體IHA與競爭ELISA檢測結果的對比

在300份血清中，IHA方法檢測合格率為95.3% （286/300）；而ELISA方法檢測陽性率為93.6% （281/300）。兩種檢測方法合格（陽性）樣品一致符合率為95.4%（273/286）；樣品總符合數279份，一致符合率為93.0%（279/300），見表1。

表1　豬瘟抗體IHA與競爭ELISA檢測的對比結果（份))

2.2豬瘟抗體IHA的log2值與ELISA的阻斷率對比

根據IHA檢測抗體的log2值由低到高排序，對應ELISA檢測抗體阻斷率，找出兩種檢測方法的共同合格（陽性）樣品數，計算陽性符合率，詳見表2。

表2　IHA的效價（log2值)與ELISA的陰陽性對比結果

2.3部分樣品IHA的log2值與ELISA的阻斷率比較

在抗體檢測過程中，發現三組數據有較明顯不同，序號1～10樣品為散養的中豬血清，豬瘟抗體IHA效價log2值為10，競爭ELISA的阻斷率在30%～45%之間；序號11～20樣品為規模豬場的母豬血清，IHA效價log2值為8，競爭ELISA的阻斷率在7.0%～8.0%之間；序號21～40樣品為散養的中豬血清，IHA效價log2值為3～8之間，競爭ELISA的阻斷率在8.0%～32.0%之間，詳見表3。

3　結果分析與討論

⑴從表1可以看出，按文件要求的判定標準時，IHA的檢測合格率為95.3%，比競爭ELISA的檢測陽性率（93.6%）高1.7個百分點，經統計學X2檢驗，兩種檢測方法差異不顯著（＞0.05），說明IHA方法的合格率與競爭ELISA方法的合格率差異不明顯，其結果與戴愛玲等[1]、趙鑫[2]等的試驗結果一致。兩種檢測方法的樣品總符合數279份，總符合率為93.0%，合格（陽性）樣品符合率95.4%，結果表明，總體上符合率均達到93%以上，兩者有很好相關性，這與何雁南等的試驗結果一致[3]。

⑵從表2可以看出，在IHA抗體log2值升序的各個區域值，競爭ELISA抗體檢測結果均出現陽性和陰性，但兩者合格（陽性）符合率很高，在91.7%～100%之間；另外競爭ELISA檢測抗體陽性符合率并沒有隨著IHA抗體log2值的升高而升高，說明兩種方法之間還是存在一些不一致性。

⑶從表3中分析三組IHA和競爭ELISA的檢測數據差異甚大的原因，主要是與疫苗劑量和免疫后抽血間隔時間有關。序號1～10的樣品是免疫2.5頭份疫苗（兩次免疫劑量一樣）的中豬血清，抽血時間距最后一次免疫僅間隔20天，產生的中和抗體水平很高（10 log2值），但產生抗E2蛋白抗體水平則一般，競爭ELISA檢測阻斷率較高（30%～45%）；序號11～20的樣品是免疫4頭份疫苗（跟胎免疫）的母豬血清，多次免疫后產生的中和抗體水平也是很高（8 log2值），抗E2蛋白抗體水平也高，體現在競爭ELISA檢測阻斷率很低（6.0% ～8.0%）；序號21～40的樣品是免疫1.5頭份疫苗（兩次免疫劑量一樣）的中豬血清，抽血時間距最后一次免疫間隔50天，由于免疫劑量僅為1.5頭份，產生的中和抗體水平不是很高（3～8 log2值之間），且參差不齊，產生抗E2蛋白抗體水平則不錯，競爭ELISA檢測阻斷率較低（8.0%～50.0%），也參差不齊。這三組試驗結果表明IHA與競爭ELISA更沒有特定相關性[1,4]。

⑷本次試驗結果表明，采用IHA方法檢測豬瘟免疫抗體合格率略高于競爭ELISA檢測的陽性率，是因為IHA和競爭ELISA檢測方法原理機制有所不同，IHA檢測的是豬瘟疫苗免疫后血清中的全病毒抗體，競爭ELISA檢測的是血清中E2蛋白產生的抗體。全病毒抗體可能是含有其他抗體的中和抗體，如BVDV抗體等；抗E2蛋白抗體則是豬瘟疫苗免疫后產生的，是豬瘟病毒的主要抗原蛋白,具有種屬特異性，因此，血清中全病毒抗體的量會多于單一抗體。

表3　部分IHA的log2值與ELISA的阻斷率比較

4　小結

⑴通過本次試驗比較,一方面，IHA的檢測合格率95.3%高于ELISA的檢測陽性率93.6%，兩種檢測方法無統計學上的差異，說明IHA與競爭ELISA檢測方法有很好的相關性[1]，但另一方面，單個樣品中也會存在明顯差異，證實兩者之間沒有特定關聯性[4]。

⑵本試驗結果表明，基層采用IHA方法評價豬瘟免疫抗體是可行的，但因肉眼判定，主觀性誤差較大，而ELISA檢測由儀器自動讀取，誤差小；從診斷試劑的穩定性上看，ELISA試劑性能穩定、重復性好，IHA試劑性能不夠穩定，重復性差[1,2,4]；即兩種方法各有優缺點，要因地制宜采用。

參考文獻

[1]戴愛玲,要曉華,楊小燕,等.間接血凝試驗與酶聯免疫吸附試驗檢測豬瘟抗體的比較.見:福建省畜牧獸醫學會.福建省畜牧獸醫學會2009年學術年會論文集[C].福州:福建省農科院畜牧獸醫研究所. 2009. 123-125.

[2]趙鑫,趙明娟,高洋,等.兩種檢測豬瘟免疫抗體實驗對比試驗[J].當代畜牧, 2014(9):53-54.

[3]何雁南,欒后利,董曉輝,等.檢測豬瘟抗體間接ELISA方法的建立及應用[J].養殖與飼料, 2007(7):5-8.

[4]王治方,郭成留,張清華,等.兩種不同方法對豬瘟免疫效果評估對比試驗[J].中國畜牧獸醫, 2007, 34(9):99-100.

中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4645(2015)10-0047-03

收稿日期：2015-05-22

作者簡介：湯海平（1965-），漢族，福建云霄人，高級獸醫師，長期從事動物臨床獸醫和實驗室檢測工作，E-mail:thp2@163.com