免疫性肝纖維化大鼠血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度的相關(guān)性研究

張姣麗,賈小芳,尹林,馮艷玲,呂建新,張麗軍

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

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免疫性肝纖維化大鼠血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度的相關(guān)性研究

張姣麗1,2,賈小芳1,尹林1,馮艷玲1,呂建新2,張麗軍1,2

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

目的 探討血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度的相關(guān)性。 方法 通過注射豬血清構(gòu)建不同分期大鼠肝纖維化模型。采用Agilent 1100，通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatograph，HPLC)測(cè)定大鼠血漿中的氨基酸濃度。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度之間的相關(guān)性。結(jié)果 根據(jù)柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定的大鼠血漿中16種游離氨基酸含量及Spearman等級(jí)相關(guān)分析和方差分析發(fā)現(xiàn)：血漿組氨酸(histidine，His)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、蘇氨酸(threonine，Thr)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、纈氨酸(valine，Val)等與肝纖維化程度具有相關(guān)性(His:rs=0.512,P=0.015; Phe:rs=0.713,P<0.01; Thr:rs=0.567,P=0.006; Tyr:rs=0.753,P<0.01; Val:rs=0.508,P=0.016)； His 、Phe和Tyr在不同肝纖維化病理分期中的濃度均與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在不同病理分期間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 血漿中His 、Phe和Tyr濃度與肝纖維化程度正相關(guān)，但對(duì)肝纖維化病理分期無判別意義。

肝纖維化；氨基酸；HPLC

肝臟是人體最大的消化器官，肝臟疾病嚴(yán)重影響著人類身體健康。在中國(guó)，約有近6億乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者， 其中1.3億為HBV攜帶者，而約有3億是肝炎(hepatitis B，HB)患者。每年近30萬人死于肝硬化和肝癌等肝臟疾病, 其中約50%死于肝癌[1-2]。大多數(shù)肝臟疾病都會(huì)經(jīng)歷由肝炎、肝纖維化到肝硬化甚至肝癌的病理過程，其中肝纖維化是逆轉(zhuǎn)病情的一個(gè)關(guān)鍵階段。因此，早期診斷治療肝纖維化具有顯著的意義。而目前肝纖維化的診斷主要依賴病理結(jié)果，無創(chuàng)的早期診斷仍然缺乏。血漿中由各種氨基酸及其濃度組成的氨基酸譜，即氨基酸模式，蘊(yùn)涵著反映機(jī)體代謝和功能狀態(tài)的重要生物化學(xué)信息，對(duì)慢性肝病疾病狀態(tài)的診斷具有診療意義。但是由于臨床研究很難動(dòng)態(tài)觀測(cè)肝纖維化的整個(gè)發(fā)展過程，使得尋找肝纖維化早期診斷分子比較困難。免疫性肝纖維化模型[3-5]因能夠很好地模擬HBV引起的慢性肝臟損傷而被廣泛用來進(jìn)行肝纖維化的研究。在眾多免疫性肝纖維化模型中，由豬血清注射于大鼠后，引起的肝門靜脈周圍單核細(xì)胞滲入和纖維化應(yīng)答與人類非常相似，因此被應(yīng)用得最為廣泛。很多研究工作者采用該模型[6]研究人類肝纖維化疾病, 尤其是由HBV引起的肝纖維化[7]。因此，本研究擬通過建立大鼠肝纖維化模型系統(tǒng)性研究該模型肝纖維化演變中氨基酸的動(dòng)態(tài)變化過程，旨在探討血漿氨基酸與肝纖維化程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠40只，體質(zhì)量180～200g，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2010-0024， 本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，24 ℃恒溫、恒濕及12 h節(jié)律光照，普通鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。

1.2 主要儀器與試劑 Agilent 1100系列高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph，HPLC)，BACKMAN COULTER 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司，Microfuge 22R)；Eppendorf 微量移液器，純乙腈(acetonitrile，ACN)、甲醇(MeOH) 購(gòu)自美國(guó)Merck公司，甲酸(FA) 購(gòu)自美國(guó)Fluka 公司，四氫呋喃購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，醋酸、硼酸、醋酸鈉、三乙醇胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型構(gòu)建:雄性SD大鼠40只，分籠飼養(yǎng)1周后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只，共8籠。免疫性肝纖維化動(dòng)物模型構(gòu)建方法與本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的文章[8]相同，即每周給予實(shí)驗(yàn)組每只大鼠腹腔注射0.5 mL豬血清2次，而對(duì)照組大鼠則予以同等體積的生理鹽水，一直持續(xù)8周。分別于造模的第2、4、6和8周，從大鼠股動(dòng)脈抽取約2.0 mL血液于EDTA抗凝管中。取血后即采用安樂死的方法處死大鼠，并從腹腔取出肝臟組織保存于10%甲醛中送病理科做HE染色切片，以判斷不同造模時(shí)期的肝臟病理變化。

1.3.2 氨基酸濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：使用日本Agilent公司生產(chǎn)的氨基酸分析標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品共有5個(gè)濃度，分別為10、25、100、250和1000 nmol/μL。每種標(biāo)準(zhǔn)品含17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸：天門冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，絲氨酸(Ser)，組氨酸(His)，甘氨酸(Gly)，蘇氨酸(Thr)，丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，酪氨酸(Tyr)，胱氨酸(Cys-SS-Cys)，纈氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，異亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，賴氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)。

樣品溶液制備：將上述采集于 EDTA抗凝管中的大鼠血液，放于4 ℃冰箱靜置1 h后，精確吸取100 μL血漿樣品于新的干凈EP管，并加入4倍體積的無水甲醇，充分混勻后，再次放入4 ℃冰箱靜置30 min。 4 ℃，12000 r/min，離心20 min后留取上清，重復(fù)離心1次，取100 μL上清即樣品溶液進(jìn)行上樣。

色譜條件：Agilent 1100系列高效液相色譜儀，由四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和DAD二極管陣列檢測(cè)器組成。使用Agilent Hypersil AA-ODS色譜柱(2.1×200 mm，5 μm)和保護(hù)柱；流動(dòng)相 A(500 mL)：20mM NaAc+18%TEA+0.3%四氫呋喃,用1%～2%醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.2，流動(dòng)相B (500 mL)：20% 100mM NaAc(用1%～2%醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.2)+40% ACN+40%MeOH；線性梯度：0 min 100% A，流速0.45；17 min時(shí)60%B，18 min時(shí)100%B，18.1 min時(shí)流速0.45，18.5 min時(shí)流速0.8，23.9 min時(shí)流速0.8，24 min時(shí)100%B，流速0.45，25 min時(shí)0%B；使用DAD UV檢測(cè)器，信號(hào)A=338/10 nm， 參考=390/20 nm；柱溫設(shè)為 40 ℃。采用在線衍生技術(shù)，將衍生試劑OPA、FMOC、0.4N硼酸緩沖液(pH 10.4)及ddH2O分別放入自動(dòng)進(jìn)樣器的1、2、3、4位，并將處理好的樣品按照進(jìn)樣順序依次放置進(jìn)樣器中相應(yīng)的空位。

設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣程序，具體如下：從3號(hào)瓶中吸取5.0 μL硼酸緩沖液；從1號(hào)瓶中吸取1.0 μL(OPA試劑；從4號(hào)瓶中吸取1.0 μL(水；從Sample瓶中吸取樣品；從4號(hào)瓶中吸取1.0 μL-水； 8 μL液體原位混合，最大速度，6次；從2號(hào)瓶中吸取1.0 μL-FMOC；從4號(hào)瓶中吸取1.0μl-水；9 μL原位混合，最大速度，3次；進(jìn)樣。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 免疫性肝纖維化模型由本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建。血清注射2周后， 在中央?yún)^(qū)發(fā)現(xiàn)有少量炎癥細(xì)胞濾過和纖維細(xì)胞形成，被診斷為肝纖維化S0～S1；第4周，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并纖維組織輕度增生，部分區(qū)域維隔形成，肝纖維化發(fā)展為S2；第6周，炎細(xì)胞和纖維組織增多，維隔形成較纖細(xì)，可見分隔的假小葉診斷為肝纖維化S3～S4； 到第8周，切片中可見非常明顯的維隔和假小葉，個(gè)別小鼠在本周期出現(xiàn)腹水，診斷為肝纖維化S4，而正常組的肝組織沒有病理改變(見圖1)。

圖1 大鼠肝組織病理結(jié)果ILF:實(shí)驗(yàn)組；NOR：正常組Fig.1 Histopathological results of rat liver fibrosis ILF:experiment group;NOR:normal group

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品16種氨基酸色譜分離結(jié)果 通過柱前衍生法，Agilent 1100高效液相色譜法能同時(shí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品中16種目的氨基酸(見圖2)，(1=Asp，2=Glu，3=Ser，4=His， 5=Gly， 6=Thr，7=Ala，8=Arg，9=Tyr，10=Cys-SS-Cys，11=Val，12=Met，13=Phe，14=Ile，15=Leu，16=Lys，17=Pro)。且該16種氨基酸在15 min內(nèi)即能得到很好的分離。可見該方法具有靈敏度高，血漿樣品需要量少(一般只要50～100 μL樣品)，分析速度快(每30 min分析一個(gè)樣品)，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于動(dòng)物模型樣本的研究。

圖2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜分離圖譜Fig.2 Amino acid profiles of chromatographic separation from the standard sample

2.3 血漿氨基酸濃度與肝組織病理分期之間的相關(guān)性通過柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定了大鼠血漿中以上16種游離氨基酸含量，對(duì)大鼠血漿氨基酸含量與肝組織病理分期之間進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)：Ala、Leu、BCAA/AAA 與肝組織病理分期呈低度正相關(guān)性;His、Phe、Thr、Tyr、Val、Met與肝組織病理分期呈中度正相關(guān)性；Arg、Asp、Cys-SS-Cys、Glu、Gly、Ile、Lys、Ser與肝組織病理分期不相關(guān)(見表1，*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的氨基酸)。

表1 大鼠血漿氨基酸濃度與肝組織病理分期之間的Spearman相關(guān)系數(shù)±s，nmol/μL)

2.4 血漿氨基酸濃度在不同肝組織病理分期的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果 采用SPSS軟件對(duì)柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定的大鼠血漿中游離氨基酸含量進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：在正常對(duì)照組及2、4、6、8周免疫性肝纖維化大鼠的血漿中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)的氨基酸為：Ala、Arg、Asp、His、Leu、Phe、Thr、Tyr和Val(見表2)。對(duì)有差異的氨基酸，進(jìn)一步進(jìn)行組間比較分析，其中Ala在正常組與第2周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)、Asp在第6周與第8周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)、Thr在正常組與第4周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)、Tyr在正常組與第2、4、6、8周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、0.000、0.000、0.000)、Val在正常組與第4、8周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034、0.032)、His在正常組與第2、4、6、8周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006、0.013、0.034、0.03)、Phe在正常組與第2、4、6、8周之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032、0.029、0.015、0.015)。

表2 大鼠血漿氨基酸濃度在不同病理分期之間的差異±s，nmol/μL)

3 討論

肝臟是人體的中心代謝器官，能分解人體內(nèi)所有氨基酸，在氨基酸代謝中具有極重要的地位。當(dāng)肝臟發(fā)生疾病時(shí)，血漿中氨基酸的變化也倍受到關(guān)注。Fischer[9]等人首先發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸/芳香族氨基酸摩爾比值與肝性腦病的發(fā)生有關(guān)，并將其應(yīng)用于肝性腦病的診斷。隨后的研究也進(jìn)一步表明慢性重型肝炎伴有肝性腦病者具有特征性血清氨基酸譜，表現(xiàn)為芳香族氨基酸(AAA，包括苯丙氨酸、酪氨酸)升高，支鏈氨基酸(BCAA，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)降低[10- 11]。與此同時(shí)，慢性肝功能不全、肝硬化病人血漿中色氨酸的變化也受到重視，因其與肝性腦病的發(fā)生率密切相關(guān)。最近，Michitaka 等檢測(cè)了不同病因慢性肝炎患者的血漿中支鏈氨基酸和酪氨酸的濃度，發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸和酪氨酸的濃度比值隨慢性肝組織炎癥程度和纖維化程度增加而出現(xiàn)定向變化，對(duì)判別肝臟炎癥活動(dòng)度和肝纖維化程度有一定的臨床診斷價(jià)值[12]。可見，氨基酸模式的變化與肝臟性疾病狀態(tài)存在著一定的聯(lián)系。但是，血漿氨基酸模式變化是否與慢性乙性肝炎引起的肝纖維化程度具有相關(guān)性，到目前為止尚無確論。

為了進(jìn)一步明確血漿氨基酸對(duì)肝纖維診斷的價(jià)值，本研究建立了大鼠肝纖維化模型并利用Agilent 1100高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中16種氨基酸含量。經(jīng)肝組織病理學(xué)證實(shí)，不同分期的大鼠肝纖維模型被成功構(gòu)建。在肝纖維化不同分期狀態(tài)下檢測(cè)血漿中氨基酸含量，經(jīng)研究分析發(fā)現(xiàn)組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)等與肝纖維化程度具有相關(guān)性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)His 、Phe和Tyr在不同肝纖維化病理分期中的濃度均與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在不同病理分期間卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；提示血漿氨基酸濃度有助于判別肝組織正常狀態(tài)與肝纖維病理狀態(tài)，但不能區(qū)分肝纖維化的病理分期。組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)酪氨酸(Tyr)屬于芳香族氨基酸，亮氨酸、異亮氨基酸、纈氨酸屬于支鏈氨基酸。本研究肝纖維化模型中芳香族氨基酸和支鏈氨基酸都表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，這與臨床上慢性肝病、肝硬化尤其是肝性腦病患者血漿氨基酸模式即芳香族氨基酸上升，支鏈氨基酸降低不太一致。研究還將此次大鼠模型的研究結(jié)果與同樣研究乙型肝炎相關(guān)性肝纖維化的臨床研究結(jié)果[13]進(jìn)行了比較，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)：在肝纖維化前期，臨床乙型肝炎相關(guān)肝纖維化患者的Phe和Tyr的變化趨勢(shì)與免疫性大鼠模型的變化趨勢(shì)基本一致。在此之前，Morgan[14]等對(duì)不同病因慢性肝病患者的血漿氨基酸模式也進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)慢性活動(dòng)型肝炎 、病毒性肝炎 、 隱源性肝炎、酒精性肝炎或肝硬化 、原發(fā)性膽汁性肝硬化 、 酒精性脂肪肝的血漿氨基酸模式的變化不完全一致。因此導(dǎo)致本研究這種結(jié)果的原因可能與不同病因慢性肝病患者血漿氨基酸模式的變化存在差異有關(guān)。

盡管多種致病因素造成的肝臟損傷導(dǎo)致氨基酸變化的機(jī)制較為復(fù)雜。根據(jù)本研究初步分析，血漿His 、Phe和Tyr濃度與慢性乙型肝炎相關(guān)性肝纖維存在著正相關(guān)，但其診斷慢性乙型肝炎相關(guān)性肝纖維化程度的臨床價(jià)值還有待評(píng)估。利用血漿氨基酸變化趨勢(shì)診斷慢性乙型肝炎肝組織病理狀態(tài)的實(shí)踐價(jià)值還需要進(jìn)一步評(píng)估和優(yōu)選。

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(編校：譚玲)

Correlativity analysis between plasma concentrations of amino acids and liver fibrosis progression in immune hepatic fibrosis model

ZHANG Jiao-li1,2,JIA Xiao-fang1,YIN Lin1,FENG Yan-ling1,LV Jian-xin2,ZHANG Li-jun1,2

(1.Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China; 2.School of Laboratory Medicine and Science,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between plasma amino acid concentration and the degree of liver fibrosis.MethodsRats were administrated with swine serum to induce different stages of liver fibrosis. Plasma concentrations of amino acids were determined by the Agilent 1100 high performance liquid chromatography (HPLC) and the correlation between the plasma amino acid concentration and the liver fibrosis progress was studied by statistical method.Results16 kinds of amino acids in serum of rats were measured by HPLC pre-colum derivatization.According to the analysis of correlation and variance, histidine, phenylalanine, threonine, tyrosine and valine were related with liver fibrosis progression(His:rs=0.512,P=0.015; Phe:rs=0.713,P<0.01; Thr:rs=0.567,P=0.006; Tyr:rs=0.753,P<0.01; Val:rs=0.508,P=0.016).There were significant differences of His,Phe and Tyr concentration between liver fibrosis at different pathological stages and normal group, but no significant difference between the different pathological stages. ConclusionThe concentration of His, Phe and Tyr in plasma has positive correlation with the liver fibrosis progress, but have no discriminant significance for pathological stage.

hepatic fibrosis; amino acid; HPLC

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271834)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2011CB910700)；重大新藥創(chuàng)制(2012ZX09303013)

張姣麗，女，碩士在讀，研究方向：結(jié)腸癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究，E-mail：15000388915@163.com；張麗軍，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：藥代動(dòng)力學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)，E-mail：zhanglijun1221@163.com。

R3

A

1005-1678(2015)01-0052-05