青藤堿對小鼠復發性自然流產妊娠結局的影響及其相關機制研究

肖麗,李坤

(1.山東省交通醫院 婦產科，山東 濟南 250031；2.山東省醫學科學院附屬醫院 婦產科，山東 濟南 250031)

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青藤堿對小鼠復發性自然流產妊娠結局的影響及其相關機制研究

肖麗1,李坤2

(1.山東省交通醫院 婦產科，山東 濟南 250031；2.山東省醫學科學院附屬醫院 婦產科，山東 濟南 250031)

目的 研究青藤堿對復發性自然流產模型小鼠妊娠結局的影響及相關機制。方法 雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠20只、Balb/c小鼠10只，按雌雄比例2:1合籠，檢出陰栓者計為妊娠第1天。分為正常組：雌性CBA/J小鼠×雄性Balb/c小鼠，正常飲食，9只孕鼠；模型組：雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠，正常飲食，10只孕鼠；治療組：雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠，自檢出陰栓日開始改用含有0.5%青藤堿的飼料，10只孕鼠。計數存活胚胎數和丟失胚胎數，并計算胚胎丟失率。使用ELISA法檢測血清中細胞因子IFN-γ和IL- 4的水平；real-time PCR檢測IL-4、INF-γ、GATA-3、T-bet基因的表達水平；Western blot測IL-4、INF-γ、GATA-3、T-bet蛋白的表達水平。結果 胚胎丟失率結果表明：與模型組比較，正常組和治療組的胚胎丟失率顯著降低(P<0.01)。ELISA結果顯示：與正常組相比較，模型組和治療組中血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4的水平均顯著升高(P<0.01)，IL-4水平均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，治療組中血清中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4 比值均顯著降低(P<0.01)，而IL-4水平變化不大。Real-time PCR和Western blot的結果均顯示：與正常組相比較，模型組和治療組中IL-4、GATA-3 基因的表達水平均顯著降低(P<0.01)；IFN-γ、T-bet 基因的表達水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3比值均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，治療組中IFN-γ、T-bet 基因的表達水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值顯著降低(P<0.01)。結論 青藤堿可以減少復發性自然流產的發生，其中RSA與Th1/Th2 平衡漂移至Th1 型有關；青藤堿治療復發性自然流產的可能機制為降低體內Th1型細胞因子IFN-γ及轉錄因子T-bet 的水平，從而調節Th1/ Th2 平衡。

青藤堿；復發性自然流產；INF-γ；IL-4；T-bet；GATA-3

目前免疫型復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)的主要表現為正常妊娠免疫反應失衡， 涉及到特異性人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)表達增加， 1型輔助性T細胞(helper T cell-1，Th1)/2型輔助性T細胞(helper T cell-2，Th2)的細胞因子平衡失調等致流產。治療主要采用免疫治療方案[1-2]， Th1 以分泌 白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等為主，這些細胞因子起免疫殺傷作用，直接或間接損害早期胎盤細胞分化和生長，對胚胎發育有毒性作用，可以導致流產；Th2 以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及IL-13 等為主，這些因子主要介導 B細胞增殖抗體生成，輔助體液免疫，產生和介導同種排斥反應的免疫耐受。國內外的研究證明，Th1 與 Th2 細胞因子平衡與妊娠結局關系密切[4]。對于自身免疫型RSA 的治療主要為抑制免疫性炎癥和阻止血栓形成，常用的藥物有腎上腺皮質激素如潑尼松，抗凝藥物如低分子肝素和小劑量阿司匹林[5-7]。同種免疫型RSA 主要采取主動免疫治療，在臨床上可以采用患者丈夫的淋巴細胞進行脫敏，促進母體產生保護性封閉因子，從而抑制母胎免疫排斥反應以保護妊娠[8-9]。

祖國醫學對RSA 認識已久，對其辨證分型以及治療也有較為系統的研究，許多中藥制劑如助孕Ⅰ號、Ⅱ號，養血安胎顆粒，柴苓湯等都被用來治療RSA，并取得了一定的療效[10-12]。青藤堿(sinomenine，SIN)是從中藥青風藤中提取出來的一種單體生物堿，目前藥用的多為青風藤的鹽酸鹽。青藤堿有明顯的抗炎作用，可以在不同程度上抑制體液免疫和細胞免疫。有研究表明，青藤堿對人外周血和小鼠脾淋巴細胞有抑制作用[13]，對T 細胞的活化和Th1 型細胞因子的釋放也有抑制作用[14]。盡管青藤堿藥理作用很廣泛，但是目前青藤堿的臨床應用主要在治療風濕病、心律失常和強直性脊柱炎，近年來，也用于治療慢性腎炎、腎小球疾病和腫瘤等，但青藤堿用于治療復發性自然流產則少見報道。本研究首先建立RSA的小鼠模型，再通過比較正常妊娠、自然流產模型和青藤堿治療各組孕鼠胚胎丟失率的變化，并檢測各組孕鼠Th1和Th2型細胞因子、相關轉錄因子的表達變化和Th1和Th2型細胞平衡情況(IFN-γ/IL-4、T-bet/GATA-3 比值反映) ，旨在探討青藤堿對RSA是否有治療作用及可能的治療機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 健康雌性CBA/J(60只)、雄性DBA/2(20只)購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號：SCXK(京)2009-0015)；Balb/c雄性小鼠(10只)購自湖北省疾病預防控制中心(許可證號：SYXK(鄂)2008-0014)，所有動物均是SPF級，8周齡，平均體質量(85±3.55)g。

1.2 藥品與試劑 含有0.5%青藤堿的飼料(青藤堿購于上海融禾醫藥科技發展有限公司，0.5%青藤堿飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司加工合成)；RT-PCR試劑盒(Fermentas 公司)；SYBR Premix Ex TapTM(Takara，寶生物工程有限公司)；IL-4、IFN-γ、GATA3 和T-bet 上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)；十二烷基磺酸鈉(SDS)(美國Sigma 公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)(杭州碧云天生物技術研究所)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.3 動物分組 所有動物均飼養于實驗動物中心SPF動物房，自由飲食飲水，飼養環境相同。適應性喂養2天后，將雌性CBA/J隨機分為3組，每組20只，分別與雄性DBA/2和Balb/c小鼠按雌雄比例2:1合籠交配，合籠后第2天早上8點檢測雌鼠陰栓，檢出陰栓者計為妊娠第1天，分別建立模型。

從每組20只中隨機選取10只模型建立成功的小鼠分為：正常妊娠組(以下簡稱正常組)(CBA/J、BALB/c)：9只，正常飲食；自然流產模型組(以下簡稱模型組)(CBA/J、DBA/2)：10只，正常飲食；青藤堿治療組(以下簡稱治療組)(CBA/J、DBA/2)：10只，自檢出陰栓日開始改用含有0.5%青藤堿的飼料。本文所有實驗嚴格遵循《實驗動物保護條例》。

1.4 觀察指標

1.4.1 各組胚胎丟失率：妊娠第13天內眥靜脈取血后，頸椎脫臼法處死各組CBA/J 小鼠，打開腹腔，暴露子宮，用眼科剪刀分離出子宮，用生理鹽水洗凈后置于干凈濾紙上，計數存活胚數和丟失胚胎數，并計算胚胎丟失率(R)。

胚胎丟失的判斷：丟失胚胎的體積明顯縮小，胎兒-胎盤單位有明顯的出血或壞死，胚胎組織變性或壞死；

胚胎丟失率的計算：胚胎丟失率(R)=丟失胚胎數/(丟失胚胎數+存活胚胎數)×100%，觀察時間為妊娠第13天。

1.4.2 血清中IFN-γ和IL- 4的水平：血清細胞因子水平的測定按照ELISA 試劑盒操作程序進行；測定：以空白孔調零，在450 nm 波長下測量各孔的吸光度值(OD 值)；測定需要在加入終止液后15 min 內進行。

1.4.3 蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及T-bet 基因的表達水平：取0.2 mL無RNA酶的EP管，加入RNA模板5 μL，Oligo(dT)15(10 μM)2 μL，dNTP(2.5 mM) 2 μL，用DEPC處理水調整體積至14.5 μL，70 ℃處理5 min，短暫離心后置于冰上，再依次加入5×緩沖液4 μL；RNA酶抑制劑 0.5 μL；M-MuLV 反轉錄酶 1 μL；DEPC水調整總體積至20 μL震蕩混勻后離心，設置反應條件為：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。得到的cDNA 產物-20 ℃保存備用。以逆轉錄得到的cDNA 產物為模板，擴增IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及 T-bet的序列。PCR反應體系總體積20 μL，其中2×SYBR Premix ExTapTM10 μL, 2.5 μmol/L 引物 2 μL(上下游各1 μL), 50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL, cDNA temples 1 μL, dH2O 6.6 μL。設置反應條件為：95 ℃ 30 s 預變性,95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，60 ℃ 60 s，共40 個循環；60 ℃ 34 s收集熒光信號。每1個樣本做 3 個平行管。基因表達的相對變化采用△△Ct 法處理。統計分析時△Ct 表示基因的相對定量，Ct 值表示目的基因產物達到閾值所需要的循環數。△Ct=△Ct(樣品)-△Ct(內參)，△△Ct=△Ct(樣品)-△Ct(標準)。

1.4.4 蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及T-bet蛋白的表達水平：蛋白濃度測定按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行；570 nm波長檢測各管蛋白吸光度；繪制蛋白濃度曲線，計算各樣品蛋白濃度；用PBS將蛋白樣品濃度稀釋至5 μg/μL，EP 管分裝，-70 ℃保存。

2 結果

2.1 胚胎丟失率 本實驗中共30 只雌鼠，中途意外死亡1 只。各組胚胎丟失情況見表1。與模型組比較，正常組和治療組的胚胎丟失率顯著降低(P<0.01)。

表1 各組孕鼠胚胎丟失率

*P<0.01，與模型組相比較，compared with model group

2.2 ELISA檢測血清中IFN-γ、IL- 4 水平 以各組孕鼠子宮蛻膜組織中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4蛋白的表達水平見表2。與正常組相比較，模型組和治療組中血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4的水平均顯著升高(P<0.01)，IL-4 水平均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，治療組中血清中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4 比值均顯著降低(P<0.01)，而治療組的IL-4水平變化不大。

表2 各組血清IFN-γ、IL- 4 和IFN-γ/IL-4水平

#P<0.01，與正常組相比，compared with normal group；*P<0.01，與模型組相比，compared with model group

2.3 各組蛻膜中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 基因的相對表達量 由IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 和GAPDH 基因的擴增曲線和熔解曲線(見圖1)，所有基因的擴增效率均恒定，已達到平臺期，Ct 值即閾值循環數穩定；熔解曲線均呈單峰，表示引物的特異性好，無引物二聚體產生。故可以使用該體系對目的基因進行定量分析。

圖1 IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 和GAPDH 基因的擴增曲線和熔解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve of IFN-γ, IL-4, GATA-3, T-bet and GAPDH gene

按照公式相對表達量RQ(relative quantity)=2-△△Ct分別計算各組孕鼠子宮蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 基因的相對表達量，見表3。與正常組相比較，模型組和治療組中IL-4、GATA-3基因的表達水平均顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；IFN-γ、T-bet 基因的表達水平以及IFN-γ/IL-4比值、T-bet/GATA-3 比值均顯著升高(P<0.01)，差異有統計學意義。與模型組相比，治療組中IFN-γ、T-bet 基因的表達水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義。

表3 各組IFN-γ、IL- 4、GATA-3和T-bet 基因的相對表達量

#P<0.01與正常組相比，compared with normal group；*P<0.01，與模型組相比，compared with model group

2.4 Western blot檢測蛻膜中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 的水平 以各組孕鼠子宮蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet蛋白的表達水平與GAPDH 蛋白的表達水平的比值作為各蛋白的相對表達量，見表4。與正常組相比，模型組和治療組中IL-4、GATA-3蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.01)，IFN-γ、T-bet 蛋白的表達水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，治療組中IFN-γ、T-bet蛋白的表達水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值顯著降低(P<0.01)。蛋白條帶圖可以看出IFN-γ、T-bet 、GATA-3、IL-4的表達情況，見圖2。

表4 各組IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 蛋白的相對表達量

#P<0.01，與正常組相比，compared with normal group；*P<0.01，與模型組相比，compared with model group

圖2 各組IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 蛋白表達1-3 正常組;4-6 模型組;7-9 治療組Fig.2 The protein expression levels of IFN-γ,IL- 4,GATA-3,T-bet 1-3 normal group; 4-6 model group;7-9 treatment group

3 討論

RSA發生與Th1/Th2平衡有關，以Th1來源的 IL-2，IFN-γ等不利于妊娠，導致流產。而以Th2來源的IL-4等有利于妊娠。研究證實，IFN-γ產生減少與Thl型反應減弱有關，T-bet 的表達與 IFN-γ的誘導產生一致[15]。研究顯示，T-bet 選擇性表達于 Th1 細胞而非 Th2 細胞[16]，T-bet 小鼠顯示 Th1 極化的缺陷。T-bet還可下調 GATA-3 基因表達。T-bet 和 GATA-3通過染色質的改型分別激活 Th1 細胞因子 IFN-γ 和Th2 細胞因子 IL-4的轉錄。 細胞毒性 T 細胞抗原 4(cycotoxic T lymphocyte associtated antigen-4，CTLA4)可抑制 GATA-3 mRNA 表達和 Th2 細胞分化。 報道顯示[18-19]，轉導子 GATA連接蛋白-3(GATA-3)和T細胞表達的 T 盒(T-bet)與 Th1/Th2平衡有關。因此，對妊娠結局而言，重要的是Th1/Th2的平衡。 在自然流產小鼠模型的相關研究中也發現， 流產的發生與Th1型細胞因子增高，Th2型細胞因子下降有關；外源性抗原誘導妊娠免疫耐受的機制可能與其促使Th1向 Th2轉化，從而降低胚胎吸收率有關，中國最新研究表明，蛻膜組織中T-bet和GATA-3 表達異常與 URSA 發病相關[17]。

有研究報道，青藤堿可以對IL-2 膜受體的表達產生抑制作用，但是不影響IL-2 的分泌，提示青藤堿治療風濕性關節炎的機制之一是調節細胞因子的產生，抑制IL-2 膜受體[20]。另有研究認為慢性腎炎患者的外周血有核細胞中T-bet mRNA 的水平高于健康對照組，給予青藤堿治療后，T-bet mRNA 的高水平被抑制，同時血清中IFN-γ的水平也被抑制。T-bet 對 Th1細胞因子有正性調節作用，而 GATA-3 則正性調節 Th2細胞因子的分泌，因此，T-bet/ GATA-3 的比率是一個反映 Th1/ Th2平衡的很好的指標。有研究檢測原因不明的 RSA 婦女蛻膜組織中 T-bet、GATA-3 的表達，發現 T-bet 表達增加而 GATA-3 表達下降，表明 T-bet、GATA-3 也參與了 RSA的發病過程。 本研究中，T-bet 和 GATA-3 在各組中的表達變化分別與 IFN-γ和 IL-4 的變化一致，即模型組孕鼠蛻膜組織中T-bet mRNA和蛋白表達量明顯高于正常組，而GATA-3 明顯低于正常組，提示 T-bet、GATA-3 表達的變化與 RSA有密切聯系，與以往研究結論一致[20]。這些研究均提示青藤堿可以直接或者間接抑制Th1 型細胞因子IFN-γ 和轉錄因子T-bet 的表達，從而影響Th1/ Th2 平衡。

多項研究表明，以 Th2型細胞因子為主的 Th1/Th2平衡可以導致免疫耐受從而維持正常妊娠，而RSA的免疫應答過程則表現為以Th1型細胞因子為主的Th1/Th2失衡[13]。本研究亦發現，模型組孕鼠蛻膜組織中 IFN-γmRNA和蛋白表達量以及外周血中 IFN-γ水平均明顯高于正常組，而IL-4明顯低于正常組，與以往研究結論一致，即 Th1 型細胞因子可以導致胎盤損傷胎兒發育受阻而引起流產，Th2 型細胞因子則對胎兒生長發育和維持妊娠有一定作用，RSA 的發生于 Th1/Th2 平衡偏向 Th1型有關。同時本研究中IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 蛋白表達量與低于模型組但是高于正常組且有統計學差異，說明青藤堿可以調整Th1/Th2失衡情況。

本研究中，青藤堿可以減少復發性自然流產的發生，其中RSA與Th1/Th2 平衡漂移至Th1 型有關；青藤堿治療復發性自然流產的可能機制為降低體內Th1型細胞因子IFN-γ及轉錄因子T-bet 的水平，從而調節Th1/ Th2 平衡。

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(編校：王冬梅)

Research the influences of sinomenine on pregnancy outcome of mice with recurrent spontaneous abortion and its mechanism

XIAO Li1,LI Kun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital in Shandong Province, Jinan 250031, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences, Jinan 250031, China)

ObjectiveTo investigate the influences and the mechanism of sinomenine on pregnancy outcome of mice with recurrent spontaneous abortion.MethodsAccording to the proportion of female and male 2:1 cage,60 female CBA/J mice, 20 male DBA/2 mice,10 Balb/c mice, it was detection of pessary which counted as first day of pregnancy.It was divided into three group,the normal group：female CBA/J mice×male Balb/c mice, normal diet,9 pregnant mice;Model group: female CBA/J mice×male DBA/2 mice, normal diet,10 pregnant mice;treatment group: female CBA/J mice×male DBA/2 mice, when self checking out the vaginal plug day, the mice were fed with containing 0.5% of sinomenine, 10 pregnant mice.Counting the number of embryos and embryos survive loss, and calculated the rate of embryo loss.ELISA method was used for the detection of serum cytokines, IFN-γ and IL- 4 level;the expression level of IL-4, INF-γ, GATA-3, T-bet gene were detected by real-time PCR;the level of IL-4, INF-γ, GATA-3, T-bet protein were measured by Western Blot method.ResultsRate of embryo loss results showed that: compared with the model group, the rate of embryo loss of the normal group and the treatment group was decreased significantly(P<0.01), the difference was statistically significant.ELISA results showed that: compared with the normal group, model group and treatment group in serum IFN-γ and IFN-γ/IL-4 levels were significantly increased (P<0.01), the levels of IL-4 were significantly decreased (P<0.01), the difference was statistically significant; compared with the model group, the treatment group in serum IFN-rlevel and the ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly decreased (P<0.01), but the level of IL-4 changed little, no significant difference.The results of real-time PCR and Western blot indicated that compared with the normal group, the expression level of IL-4 and GATA-3 genes in model group and treatment group were significantly decreased (P<0.01); the expression level of IFN- γ, T-bet gene and IFN-γ/IL-4 ratio and T-bet/GATA-3 ratio were significantly increased (P<0.01).Compared with the model group, the expression level of IFN- γ, T-bet gene and IFN-γ/IL-4 ratio, T-bet/GATA-3 ratio in treatment group was significantly decreased (P<0.01). ConclusionSinomenine can effectively reduce the occurrence of recurrent spontaneous abortion.RSA and Th1/Th2 relate to drift balance to Th1,mechanism of sinomenine in treatment of recurrent spontaneous abortion may be to reduce the levels of Th1 type cytokines IFN-γ and transcription factor T-bet levels, thereby regulating the balance of Th1/ Th2.

sinomenine; recurrent spontaneous abortion; INF-γ; IL-4; T-bet; GATA-3

山東省自然科學基金課題項目(ZR2009CL027)；濟南市科技局科技明星計劃課題項目(20100118)；山東省醫學科學院醫學基金課題項目(201023)

肖麗，女，碩士，主治醫師，研究方向：子宮內膜異位癥發病機制及診療，E-mail：xl1821460022@163.com。

R714.21

A

1005-1678(2015)01-0063-05