馬鈴薯基因轉化受體系統的初步研究及建立*

張西英，劉江娜，白云鳳，閆建俊，張愛萍*

（1.兵團第六師農業科學研究所，新疆五家渠830000；2.山西省農業科學研究院）

馬鈴薯基因轉化受體系統的初步研究及建立*

張西英1，劉江娜1，白云鳳2，閆建俊2，張愛萍1*

（1.兵團第六師農業科學研究所，新疆五家渠830000；2.山西省農業科學研究院）

本研究以馬鈴薯品種大西洋和克新一號的葉片、莖段為外植體，通過農桿菌介導法，將新近發展迅速的RNA干擾技術和無標記轉基因技術引入植物抗病毒基因工程。通過研究比較不同品種不同外植體的轉化體系的優劣以及對再生體系的優化，研究建立一種高效的馬鈴薯轉基因受體系統，為獲得馬鈴薯無標記轉基因植株奠定基礎。結果如下：（1）莖段形成愈傷組織速度較快，且愈傷誘導率明顯高于葉片誘導率，分別為82%和72%，而繼代培養時葉片的愈傷分化率高于莖段，分別為81.0%和66.7%；（2）大西洋的莖段和葉片的誘導率均高于克新一號，但由試驗數據可看出2個品種的馬鈴薯外植體的愈傷誘導率與分化率差異不大，均可作為遺傳轉化的受體。

馬鈴薯；轉基因；受體系統

農桿菌作為一種天然的植物基因轉化工具，其應用推動了植物分子生物學及生物技術的發展。隨著對農桿菌T-DNA加工、轉移及整合進植物基因組的機理的研究以及轉化技術方法的提高和改進，農桿菌介導的植物基因轉化的優越性將得到更充分的表現，已是植物基因工程中的常用方法，在植物基因轉化中廣泛應用。在眾多的轉基因植物中約有80%是由農桿菌介導轉化完成的，是目前雙子葉植物遺傳轉化最常用的方法，迄今獲得的馬鈴薯轉基因植株也主要是通過此途徑實現的。

農桿菌介導的植物遺傳轉化雖然已成為當今植物遺傳轉化的主要途徑之一，但仍需對一些問題做進一步研究。如農桿菌介導的遺傳轉化具有基因型依賴性，同一植物的不同基因型對農桿菌的敏感性的不同，致使轉化效率存在較大的差異，主要原因是基因型不同，其細胞分化所需的激素種類、激素濃度及激素之間的配比也不同，進而影響到愈傷組織的形成及芽和根的分化。即使在轉化頻率比較高的植物（馬鈴薯、煙草、擬南芥等）中也有很大的基因型依賴性；可再生細胞部位與轉化感受態細胞部位不一致，導致假轉化體的出現和轉化頻率降低等。有研究表明，馬鈴薯的轉化方法需要有賴于基因型進行選擇，且轉化效率也會因此而有所不同，甚至會有顯著差異，而且根癌農桿菌對不同基因型的反應也會有顯著差異[1]。這也是在某種植物基因轉化過程中，沒有統一標準的主要原因。

成功的基因轉化首先要依賴于良好的植物受體系統的建立。所謂植物基因轉化受體系統，是指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其它非組織培養途徑，能高效、穩定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，轉化選擇對抗生素敏感的再生系統。而馬鈴薯不同外植體的愈傷誘導及分化能力存在差異，是影響基因轉化率的因素之一，因此，本研究以馬鈴薯大西洋和克新一號的葉片、莖段為外植體，比較不同外植體的轉化體系的優劣，通過對不同品種再生體系的優化，研究并建立一種高效的轉基因受體系統，為下一步獲得馬鈴薯無標記轉基因植株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆馬鈴薯主栽培品種大西洋和克新1號的無菌苗由本實驗室制備。無菌苗在MS培養基上擴繁，取其葉片及莖段作為轉化受體材料。實驗所用菌株根癌農桿菌LBA4404和含抗馬鈴薯X病毒和Y病毒的RNA干擾基因的無標記基因植物表達載體由山西省農業科學院作物科學研究所轉基因實驗室提供。所用的基本培養基為MS培養基，包括預培養基1/4MS培養基、馬鈴薯誘導愈傷培養基GI（MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.2mg/L+Cef250mg/L）、馬鈴薯芽分化培養基GII（MS+ZTR2.0 mg/L+NAA0.01 mg/L+ GA30.01mg/L+Km50mg/L+Cef250mg/L）和馬鈴薯生根培養基（MS+IAA0.1mg/L）。其它試劑藥品購自國內外相關廠家和公司。

表1 農桿菌侵染對不同品種外植體愈傷誘導及分化情況

1.2 試驗方法

選擇長勢良好，葉片舒展，葉色良好的健壯無菌苗，將葉片沿葉基部剪下切成小塊，莖段切成不帶腋芽的小段，將2種外植體分別接種于1/4MS培養基上進行預培養2 d（25℃，暗光），使細胞處于“轉化感受態”。之后將含有無標記表達載體的農桿菌菌液稀釋到OD600為0.5，在無菌條件下，侵染經過預培養的外植體10min，侵染完成后將外植體轉入不含任何抗生素的MSGI固體愈傷誘導培養基上25℃培養3 d，經過培養后，挑選出生長狀態比較好的外植體，轉入含Cef250mg/L的MSGII芽誘導培養基上誘導生芽。經過30～45 d的培養，將愈傷組織上分化出長至1～2 cm的小芽切下，轉入生根培養基中誘導生根。將長至一定高度的幼苗取其葉片小量提取DNA并進行PCR檢測，初步篩選出轉化成功的植株。期間對外植體的成活率、愈傷組織誘導率、芽分化率等實驗數據進行觀察統計。

2 結果與分析

植物基因轉化受體系統包括外植體的選擇、高效再生系統的建立、抗生素敏感性試驗及農桿菌的敏感性試驗、建立高效的植株再生系統是進行離體選擇合格基因轉化體的前提。盡管馬鈴薯的組織培養技術已經較為成熟，但不同的基因型和不同的試驗目的所要求的條件是不同的，必須針對每個試驗所選擇的試材品種和試驗目的建立高效的植物基因轉化受體系統。

本試驗選擇馬鈴薯的葉片、莖段作為遺傳轉化受體，而外植體的再生頻率是對遺傳轉化效率影響的主要因素之一。因此，以大西洋和克新一號的莖段及葉片為外植體進行愈傷組織誘導及分化情況的初步試驗。由表1發現2種外植體在培養條件相同時，莖段形成愈傷組織速度較快，且愈傷誘導率明顯高于葉片誘導率，分別為82.0%和72.0%，而繼代培養時葉片的愈傷分化率高于莖段，分別為81.0%和66.7%。莖段的愈傷化反映的過程通常是受傷莖段的兩端先膨脹，愈傷組織一邊膨大一邊從兩端逐漸向中部產生擴展，最后整個莖段形成啞鈴狀；葉片是從周緣被切掉的受傷部位愈傷化，其愈傷組織形成時間較晚，但愈傷組織增殖的速度較莖段快，這可能是因為葉片的受傷面積較大的原因。而葉片的褐化率、污染率均高于莖段，這可能與農桿菌侵染外植體時，葉片的接觸面積大于莖段的接觸面積有關。大西洋的莖段和葉片的誘導率均高于克新一號，但由試驗數據可看出，2個品種的馬鈴薯外植體的愈傷誘導率與分化率差異不大，均可作為遺傳轉化的受體。

3 討論

一般認為，基因型的特異性與細胞的生理狀態存在關系，主要包括細胞受傷后的生理反應、細胞壁的結構、細胞內源激素的水平等。因此，在進行遺傳轉化之前，要篩選出適合轉化的基因型。張鶴齡[2]等用同一種農桿菌介導轉化4個馬鈴薯品種，結果表明，不同品種間的遺傳轉化效率差異很大，其中轉化率最高的可達79.5%，但最低的僅為6.7%，說明馬鈴薯各栽培種間的遺傳轉化率由于受基因型的影響是不同的。以同一植物不同部位或者同一部位不同發育階段的植物作為外植體，不同外植體對農桿菌侵染的敏感性是不同的。一般說來，對農桿菌侵染最為敏感的外植體是分生組織及伴有活躍細胞分裂的植物組織。因此，遺傳轉化時，選擇幼葉、幼胚、莖尖頂端分生組織、小孢子愈傷組織、懸浮細胞培養物等作為外植體比較合適。農桿菌主要感染外植體的切口部位，幼嫩的外植體比老的外植體更容易被侵染，比如利用馬鈴薯幼嫩的塊莖作為外植體進行遺傳轉化，能夠產生較多的轉化體，但有時，利用較老的植物組織作為遺傳轉化的受體材料，其切口細胞受到內外源激素的作用后也能轉化成分生能力很強的細胞團。外植體的生理狀態也會對轉化效果產生影響。熊偉[3]等在以馬鈴薯品種PB04為材料的多次試驗中發現，苗齡和植株的健壯程度也極顯著地對遺傳轉化效率產生影響，苗齡2周左右，生長健壯的外植體具有較高的遺傳轉化效率和植株再生能力，當苗齡過大，如超過1個月，或者試管苗不夠健壯，則會降低轉化率，分化成苗率則更低。因此，植物遺傳轉化頻率與植物的基因型具有很大的關系。

本試驗中，莖段、葉片屬于分化程度較高的器官，均通過脫分化誘導愈傷組織，再分化成不定芽的途徑得以再生，所以再生過程耗時較長。其優點是外植體細胞經歷了脫分化和再分化2個過程，具有易于接收外源基因的能力，因此轉化率較高，擴繁量大，可獲得較多的轉化植株，但該再生系統獲得的再生植株無性系周期長、變異大，轉化的外源基因遺傳穩定性較差。

由于植物遺傳轉化的頻率是很低的，而在整個轉基因實驗的操作過程中又會經歷預培養、侵染、共培養和鑒定、篩選等步驟的處理，會使再生頻率受到一定影響。在實際的應用和操作過程之中，只有具有高效穩定的再生能力，才能保證在盡可能小的群體中獲得實驗所需要的轉化個體，這也是獲得一定數目轉化體的基礎，因此，穩定高效的受體系統的建立是轉化成敗的關鍵因素之一。建立高效的受體系統主要要考慮2個方面的因素，即適宜的外植體、適宜的培養基。理論上植物體的任何組織和器官都可以作為建立再生系統的外植體、甚至作為植物基因轉化的外植體。但不同植物間，同種植物不同品種間，同一品種植物不同組織器官間，在脫分化能力、再分化能力、細胞全能性潛在趨勢及感受態程度等方面都有很大差別。因此，不同種類外植體對離體培養的反應是不同的，培養效果也不同，有必要選擇培養效果最好的外植體，以利于后續工作的進行。其選擇原則是：（1）選擇幼年型外植體；（2）增殖能力強的外植體；（3）具強再生能力基因型的外植體；（4）遺傳穩定性好的外植體。

在農桿菌介導的馬鈴薯轉基因中，轉化效率一般比較低，主要受基因型、預培養、菌液濃度及侵染時間、共培養等因素的影響。馬鈴薯具有豐富的基因型，有研究者認為其轉化方法需有賴于基因型進行選擇，而且轉化效率也會因此有所不同，所以各個實驗室有必要根據實際情況對前人的方法進行驗證和改進，以獲得最適的轉化條件。

[1]王春林，朱明凱，程天慶.用根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌轉化馬鈴薯的初步研究[J].馬鈴薯雜志.1990，4（l）：1-7.

[2]張鶴齡.我國馬鈴薯抗病毒基因工程研究進展[J].中國馬鈴薯，2000，14（1）：25-30.

[3]熊偉，馬耀華，胡碧波，等.根癌農桿菌介導的馬鈴薯轉化系統的優化[J].廣西農業生物科學，2007，26（1）：1-7.

2015—10—28

第六師五家渠科技計劃項目，項目編號：1506。

*通訊作者：張愛萍（1968-），女，新疆人，研究員，研究方向為作物育種研究與推廣。E-mail：379409419@qq.com。