間變性大細胞淋巴瘤動物模型的構建與鑒定*

陳芳，劉曉麗，陳玉玲，李亞軍，牟東云，白雪芹，鄧飛

（1.遵義醫學院病理科，貴州遵義563003；2.遵義醫學院附屬醫院腫瘤醫院三病區，貴州遵義563000）

·論著·

間變性大細胞淋巴瘤動物模型的構建與鑒定*

陳芳1，劉曉麗1，陳玉玲1，李亞軍2，牟東云1，白雪芹1，鄧飛1

（1.遵義醫學院病理科，貴州遵義563003；2.遵義醫學院附屬醫院腫瘤醫院三病區，貴州遵義563000）

目的探索間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）小鼠模型的構建方法。方法選取BALB/c小鼠為研究對象，環磷酰胺抑制小鼠機體免疫功能，用Karpas299細胞在小鼠體內建立ALCL模型。結果①ALCL模型成功建立，免疫組織化學結果顯示，CD30和間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽性；②聚合酶鏈反應（PCR）結果顯示，核基因重組激活基因2（RAG2）條帶陽性，大小517 bp；③環磷酰胺腹腔注射后，小鼠外周血CD3、CD8、CD19和CD20陽性細胞比例顯著降低，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；④成瘤組小鼠外周血CD3、CD8、CD19及CD20陽性細胞比例顯著低于未成瘤組小鼠（P＜0.05）。結論采用環磷酰胺抑制小鼠機體免疫功能，可成功構建BALB/c小鼠ALCL模型；細胞免疫功能低下可能是模型成功建立的原因或機制。

BALB/c小鼠；環磷酰胺；間變性大細胞淋巴瘤；Karpas299細胞株

間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是一種T淋巴細胞來源的淋巴瘤。由于腫瘤細胞膜表面高表達CD30抗原，因而也被稱為Ki陽性大細胞淋巴瘤。目前治療ALCL的方法仍以CHOP方案化療為主，但是該化療方案對ALCL復發及晚期患者的效果不明顯。近年來，以CD30抗原為靶向的治療藥物，如Brentuximabvedotin在晚期CD30陽性[1-2]、間變性大細胞淋巴瘤[3]及霍奇金淋巴瘤的治療方面顯示出良好效果[4-5]，但是針對機體抗腫瘤方面的具體效應及藥物安全性仍需進行大量的臨床研究。由于ALCL發病率較低，約占非霍奇金淋巴瘤的2％～3％[6]，收集到足夠數量的患者作為研究對象是限制人們認識及治療該疾病的一大障礙。而臨床研究大都基于回顧性分析，因此人們對其認識和了解十分有限。建立ALCL模型，是開展ALCL發病機制、藥物療效等研究的基礎。ALCL與免疫系統的關系密切，其發生、發展與機體的免疫微環境是密不可分的。無論是由于T淋巴細胞缺乏導致細胞免疫功能缺陷的裸鼠，還是T、B淋巴細胞聯合缺乏導致細胞和體液免疫功能缺陷的SCID小鼠，又或是T、B淋巴細胞聯合缺陷同時伴有巨噬細胞、NK細胞活性降低的NOD/SCID小鼠，因其免疫功能缺陷，這些動物模型并不能真實地模擬具有免疫功能的ALCL患者。為能更真實地模擬患者的臨床發病，更好地進行針對ALCL的免疫靶向治療方面的研究，在有免疫力的小鼠身上建立ALCL動物模型尤為重要。本研究經環磷酰胺暫時抑制BALB/c小鼠免疫功能后，成功地建立ALCL荷瘤模型，并運用流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測小鼠成瘤過程中外周血T/B細胞表型的變化規律，初步揭示BALB/c小鼠的成瘤免疫學機制，為后期研究奠定良好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞和動物

雌性BALB/c小鼠25只，4～6周齡，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，購自北京阜康生物科技有限公司，動物生產許可證編號：SCXK（京）2014-0004。人間變性大細胞淋巴瘤細胞株Karpas 299購于美國菌種保藏中心細胞庫。

1.2主要試劑及儀器

環磷酰胺購自吉林修正藥業集團股份有限公司，鼠抗人間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）單克隆抗體、鼠抗人CD30單克隆抗體、鼠抗人CD20單克隆抗體、鼠抗人CD45RO單克隆抗體、山羊抗鼠二抗購自北京中杉生物有限公司，Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、核基因重組激活基因2（recombination activating gene，RAG2）特異性引物購購自上海生工生物工程有限公司，抗鼠CD3、CD4、CD8、CD19、CD20熒光抗體及相應同型對照購自美國eBiosciense公司，流式細胞儀及其配套的計算機軟件數據處理系統購自美國Becton Dickinson公司。

1.3實驗方法

1.3.1 腫瘤細胞培養復蘇Karpas299，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，無血清1640培養基洗滌3次，用含有20％胎牛血清、1％谷氨酰胺及雙抗的1640培養液將細胞混勻，37℃、5％二氧化碳CO2培養箱中培養，每天換液1次。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）及免疫組織化學法檢測將25只BALB/c小鼠隨機分為5組，A組為空白對照組，其余B、C、D及E組為實驗組。用環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）250 mg/（kg·只）對BALB/c行一次腹腔注射，3 d后將制備好的ALCL細胞懸液（5×106個/0.5 ml）注入實驗組小鼠的右上肢腋下，每隔3天在小鼠相同部位皮下注射，共種植3次。注射后0～2個月觀察動物是否成瘤，待出現皮下腫塊后，取該小鼠皮下腫塊進行HE染色觀察，免疫組織化學法檢測腫瘤組織中CD30、ALK、CD45RO、CD20等抗原的表達。

1.3.3 RAG2基因表達聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測雌性BALB/c小鼠外周血中是否表達RAG2基因。按試劑盒說明書操作提取小鼠外周血DNA。BALB/c小鼠RAG2序列，正向引物：5'-GAGGAATCTCTGTCTCCAGTGC-3'，反向引物：5'-TCAACATCACAAGTAGGGCAAC-3'，產物大小517 bp。PCR反應體系為20μl。反應條件：95℃預變性3min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環。4℃保存PCR產物，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物及凝膠成像系統并拍照。

1.3.4 檢測外周血T、B淋巴細胞亞群比例的變化流式細胞術檢測建模中BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細胞亞群比例變化。取環磷酰胺處理及皮下接種Karpas299細胞后的BALB/c小鼠，觀察期為0～2個月。建模第24天將接種腫瘤細胞后的小鼠分為兩組，即成瘤組和未成瘤組。在環磷酰胺注射后的第3、10、17和24天，摘眼取血法收集小鼠外周血于抗凝管中，加入3倍體積的紅細胞裂解液，冰上靜置10 min，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加入2 ml 0.1％的BSA-PBS洗滌，離心方法同前，重復3次；加入200μl PBS重懸，分裝到流式管1號和2號各100μl；在1號管中加入1.0μl抗鼠CD3-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、0.7μl抗鼠CD19-別藻藍蛋白（Allophycocyanin，APC），在2號管中加入0.5μl抗鼠CD4-FITC、0.7μl抗鼠CD8-APC、1.3μl抗鼠CD20-藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE），各單克隆抗體相應同型對照按相同組合和相同劑量加入另外的流式管3號和4號中（抗體劑量參照美國eBiosciense公司相應流式抗體說明書）。渦旋振蕩器震蕩3次，避光孵育20 min，加入2 ml 0.1％BSA-PBS離心，棄上清液，加入1％多聚甲醛200μl固定。上機檢測或4℃避光保存，檢測外周血CD3、CD4、CD8、CD19及CD20的變化。

1.4統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用正態分布、方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（One-way，ANOVA），方差齊用LSD法，方差不齊用DunnettT3法，生存分析用Kaplan-Meier法，生存曲線的比較用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1小鼠一般及存活狀況

環磷酰胺處理后觀察各實驗組無死亡現象，Karpas299細胞懸液移植到小鼠左或右上肢皮下，實驗組（B、C、D及E組）小鼠于次日即出現明顯的急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）反應，表現為毛發豎立、不順無光澤，活動量減小，進食量下降，體重減輕等，并出現小鼠聚堆現象，個別小鼠還出現弓背體位。移植后第1周反應較重，第2周開始aGVHD反應減輕。移植后第5天開始，各移植實驗組小鼠皮下陸續出現腫塊。最后一次移植細胞至處死小鼠，共觀察60 d。移植組小鼠總體成瘤率為80％（16/20），腫瘤生長處皮膚出現脫毛及潰爛表現。僅C組有1只成瘤小鼠自然死亡，其余小鼠全部存活，為人為脫頸處死。見表1。

表1 各組小鼠成瘤率比較

2.2小鼠腫瘤的形態學觀察和鑒定

2.2.1 腫瘤的形態學觀察空白對照組小鼠（A組）未見異常變化。80％的實驗組小鼠（B、C、D及E組）于左或右上肢皮下可見明顯腫塊，觸之無波動感，因腫塊位于小鼠上肢，影響小鼠活動，致各實驗組小鼠活動量減小。解剖腫瘤組織發現，腫瘤組織固定分布于小鼠左或右上肢接種部位，與周圍組織分界不清楚，圓形或橢圓形，腫塊最大達20 mm×20 mm×10 mm，切面呈魚肉狀外觀。解剖其他臟器，未見腹水形成及腹腔臟器粘連，未見其余臟器和遠處淋巴結浸潤及轉移。小鼠種植腫瘤組織見圖1。

2.2.2 腫瘤的組織學鑒定取腫瘤組織行HE染色觀察，腫瘤細胞形態多樣、體積較大（約為2～3個組織細胞體積大小），呈圓形、橢圓形或多邊形。細胞核多樣性，呈圓形、橢圓形或不規則形，見胚胎樣核，核型彎曲，核膜一側平滑微凸，另一側凹陷見多個切跡。部分瘤細胞與霍奇金病瘤巨細胞（Reed-sternberg，R-S）的雙核瘤細胞相似，但未見診斷性R-S細胞。免疫組織化學法檢測顯示，腫瘤組織CD30陽性，ALK陽性，CD45RO陽性，CD20陰性。經鑒定為ALK陽性的間變性大細胞淋巴瘤。見圖2、3。

圖1 小鼠腫瘤解剖圖

圖2 小鼠腫瘤病理組織HE染色

圖3 小鼠腫瘤組織免疫組織化學法檢測（×400）

2.3小鼠外周血中RAG2基因的表達

PCR檢測雌性BALB/c小鼠外周血中RAG2基因表達結果顯示，擴增出RAG2基因517 bp特異性DNA條帶，而對照組NOD/SCID小鼠則未見該條帶。見圖4。

2.4不同時間BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細胞亞群比例

按照上述建模方法重新訂購36只小鼠，分別檢測注射CTX前（空白組）及注射CTX后第3、10、17和24天小鼠T/B細胞免疫表型的變化，環磷酰注射后第3天，CD19陽性細胞比例首先下降，低于空白組（P＜0.05）；第10天，所有免疫參數值低于空白組，其中CD3、CD4、CD8、CD19及CD20陽性細胞比例下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；第17天CD3、CD4、CD8及CD19陽性細胞較第10天開始回升，但CD8、CD19和CD20陽性細胞比例仍低于空白組（P＜0.05）。至建模后第24天檢測未成瘤組與成瘤組小鼠外周血T、B淋巴細胞，未成瘤組CD3、CD4、CD8及CD20陽性細胞比例明顯高于成瘤組（P＜0.05）。見表2、3。

圖4 小鼠外周血中RAG2的PCR檢測

表2 各組小鼠外周血的免疫水平變化（n=6±s）

表2 各組小鼠外周血的免疫水平變化（n=6±s）

組別CD3/％CD4/％CD8/％CD19/％CD20/％CD4/CD8空白組32.59±12.3612.72±6.6010.84±2.6826.17±5.305.92±2.401.12±0.34 CTX后第3天66.47±14.7531.46±15.899.74±0.792.16±1.279.85±2.283.16±1.36 CTX后第10天14.19±1.633.74±0.281.26±0.785.51±0.702.92±0.032.98±0.04 CTX后第17天20.94±0.3717.76±0.596.14±0.289.03±0.132.66±0.852.89±0.04 CTX后第24天25.94±1.0716.36±3.733.97±0.899.21±0.211.83±0.214.12±0.02F值10.3742.98316.23429.2028.6805.492P值0.0050.0990.0010.0000.0080.025

表3 成瘤組與未成瘤組小鼠外周血T、B淋巴細胞亞群比例（n=6，±s）

表3 成瘤組與未成瘤組小鼠外周血T、B淋巴細胞亞群比例（n=6，±s）

組別CD3/％CD4/％CD8/％CD19/％CD20/％CD4/CD8成瘤組3.83±2.122.03±0.920.41±0.231.24±1.215.27±1.715.8±4.34未成瘤組P值37.10±21.31 0.010 29.42±19.45 0.007 1.95±0.48 0.000 0.49±0.18 0.000 33.12±15.07 0.001 14.29+6.45 0.094

3 討論

1985年德國病理學家STEIN等在制備CD30單抗過程中首次描述間變性大細胞淋巴瘤，屬于惡性侵襲性T細胞淋巴瘤的一個亞型。2008年，WHO在淋巴瘤的最新分類中，根據原發系統性ALCL是否表達ALK激酶，分為ALCL陰性、ALK陽性及ALCL陰性、ALK陰性[7-9]。因其發病率極低，收集到足夠數量的ALCL臨床病例來進行ALCL藥物靶向治療方面的研究較困難，故成功建立ALCL動物模型是深入研究該疾病及其治療策略的重要途徑。ALCL屬淋巴造血系統的惡性腫瘤，與人體免疫系統密切相關，因此在具有免疫功能的小鼠身上建立腫瘤模型才能更真實地模擬腫瘤自然發生的過程。而目前建立的小鼠腫瘤動物模型中，選用的小鼠多為免疫缺陷鼠，如裸鼠、SCID及NOD/SCID小鼠[10-11]。而NOD/SCID小鼠，是SCID小鼠與非肥胖糖尿病小鼠（NOD/Lt）雜交而成，其不僅有SCID小鼠的V（D）J重排缺陷，還缺乏功能性自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）及循環補體。正常小鼠體內RAG2基因參與淋巴細胞發育和V（D）J基因的重排[12-14]。而免疫缺陷的SCID小鼠及NOD/SCID小鼠，因抗原V（D）J基因重排受阻，體內無法檢測到RAG2基因。本實驗將RAG2基因作為鑒定BALB/c小鼠與免疫缺陷小鼠的一個鑒別點。

淋巴造血系統來源的腫瘤與復雜的免疫環境密切相關，而且患者并非都有免疫缺陷。因此無論是在T細胞缺陷還是T、B細胞聯合缺陷的小鼠身上建立腫瘤模型，與真正腫瘤患者所處的免疫微環境并不一致，該模型并不能模擬具有免疫功能的ALCL患者。國內學者劉芳等[11]也在具有正常免疫力的BALB/c小鼠身上成功構建鼠源性的淋巴瘤動物模型，但在BALB/c小鼠身上建立人源性的ALCL模型國內外鮮見報道。

由于BALB/c小鼠直接接種人源性Karpas299細胞后有嚴重的免疫排斥反應，所以應首先對BALB/c小鼠進行暫時的免疫抑制后才能進行小鼠的成瘤實驗。目前，暫時抑制小鼠免疫反應的方法主要有：①移植前采取亞致死劑量照射；②移植前應用NK細胞抗體降低NK細胞活性；③使用具有免疫抑制作用的化療藥物對動物進行預處理。因環磷酰胺是一種具有強烈骨髓抑制作用的經典烷化劑類免疫抑制劑，單次高劑量一次性腹腔注射可造成機體的免疫功能暫時性下降，調節性T細胞CD4+T細胞比例下調50％左右。免疫抑制2周后，機體的免疫功能可逐漸恢復[15]。該結果與本實驗T/B細胞各亞型指標基本相符。有研究表明，大劑量環磷酰胺注射后可誘導動物對機體免疫耐受，對多種特異性抗原在一段時間內無應答反應。但是關于環磷酰胺建立動物免疫抑制模型的方法，目前國內外沒有統一的給藥劑量標準。本實驗室經過長期的實驗摸索，探索出環磷酰胺最佳建模劑量為250 mg/kg一次性腹腔注射。

本實驗選取成熟T細胞的特異性標志細胞表型CD3及其分化后的CD4+（Th）、CD8+（CTL）和B細胞表型CD19、CD20作為檢測指標。在抗瘤效應方面，CD4+T細胞的功能不僅限于輔助細胞毒T細胞，而且可以協助NK細胞清除和殺滅腫瘤，甚至還具有不依賴于CD8+CTL的腫瘤殺傷作用。CD8+CTL在腫瘤免疫中起關鍵性作用，主要通過FasL/Fas、顆粒酶的途徑直接殺傷腫瘤細胞。CD19表達于全部B細胞上，是鑒定B細胞的重要標志之一。CD20發揮調節B細胞增殖、分化的功能，在B細胞激活后逐漸丟失。B細胞產生抗瘤抗體并通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）發揮抗瘤效應，還可對各種免疫細胞進行調節或作為抗原提呈細胞參與腫瘤免疫。通過檢測經環磷酰胺處理后的外周血T、B淋巴細胞亞群發現，注射環磷酰胺第3天，CD19+B細胞開始下降，這符合B淋巴細胞較T細胞對環磷酰胺更為敏感的報道。而腫瘤細胞接種后的第1周，CD3+、CD8+細胞比例下降尤為明顯，此時機體經歷嚴重的免疫抑制過程；第10天，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+及CD20+下降到最低水平。環磷酰胺所致小鼠體內免疫功能下降，為Karpas299細胞的免疫逃逸及在小鼠體內生長創造條件，因此本實驗在注射環磷酰胺后的第3天開始注射Karpas299細胞。在實驗前期的預實驗中，筆者曾采用一次性注射腫瘤細胞的方法建立腫瘤模型，但小鼠成瘤率極低，個別成瘤小鼠有自發性消退現象。考慮為移植細胞數量太少，小鼠體內尚存的免疫功能使腫瘤細胞無法在體內存活，所以在后期實驗中筆者采用間隔注射法，即每4天1次，共注射3次，使小鼠的成瘤率達80％。流式細胞術檢測小鼠第17和24天外周血，與第10天CD3+、CD4+、CD8+、CD19+及CD20+比較，各檢測指標雖然已開始恢復，但仍較空白組低。且小鼠體內腫瘤依舊能迅速生長，分析其原因可能是小鼠體內已發生腫瘤免疫耐受，形成適合腫瘤生長的免疫微環境。

注射腫瘤細胞24 d后，按小鼠注射部位是否有可見腫塊將小鼠分為未成瘤組與成瘤組，檢測小鼠外周血中T、B淋巴細胞表型。未成瘤組CD3+、CD4+、CD8+及CD20+細胞比例較成瘤組高（P＜0.01），考慮可能是小鼠對環磷酰胺的耐受存在個體差異。即使對環磷酰胺耐受較強的小鼠按照250 mg/kg體重給藥，機體仍存在較高的免疫力，使Karpas299細胞在體內無法正常存活。同時機體龐大的免疫網絡和腫瘤的相互作用使腫瘤免疫異常復雜，腫瘤細胞在小鼠體內正常生長需經歷一系列適應過程。但未成瘤組小鼠的T、B細胞各亞群比例較成瘤組高，說明在機體的抗腫瘤免疫過程中，細胞免疫和體液免疫均為重要的免疫殺傷因素。本實驗檢測間變性大細胞淋巴瘤成瘤過程中特異性免疫細胞T、B細胞在建瘤過程中的免疫表型變化，而對T、B細胞在抗腫瘤中的具體作用及其分泌的細胞因子對腫瘤影響的研究，尚需實驗來進一步驗證。

綜上所述，本實驗使用環磷酰胺免疫抑制處理BALB/c小鼠后，可成功建立ALCL模型，為后續ALCL的免疫靶向治療提供較好的實驗基礎。

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（申海菊 編輯）

Establishment of anaplastic large cell lymphoma model in mice*

Fang CHEN1,Xiao-li LIU1,Yu-ling CHEN1,Ya-jun LI2,Dong-yun MOU1,Xue-qin BAI1,Fei DENG1
(1.Department of Pathology,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,P.R.China;2.The Third Ward,the Affiliated Tumor Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,P.R.China)

【Objective】To evaluate the establishment method of anaplastic large cell lymphoma(ALCL)model in mice.【Methods】BALB/c mice were chosen as research subjects.Cyclophosphamide(CTX)was used to inhibit the immune function of mice,and then the ALCL model was established by Karpas 299 subcutaneous injection.【Results】①ALCL model was successfully established.The immunohistochemistry result showed both CD30 and anaplastic lymphoma kinase(ALK)were positive.②The PCR result showed that the RAG2gene was positive and had 517 bp.③The percentages of CD3+,CD8+,CD19+and CD20+cells after CTX injection were lower than those before injection((P＜0.05).④The percentages of CD3+,CD8+,CD19+and CD20+cells in the tumor group were significantly lower than those in the non-tumor group(P＜0.05).【Conclusions】Using cyclophosphamide to inhibit the immune function,ALCL model of BALB/c mice can be successfully established.The low cellular immune function may be the reason or mechanism of successful establishment of ALCL model.

BALB/c mouse;cyclophosphamide;anaplastic large cell lymphoma;Karpas 299 cell line

1005-8982（2015）35-0001-06

R733

A

2015-03-25

國家自然科學基金（No：81160300）

鄧飛，E-mail：hishnuj778@126.com