小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠代謝及生殖作用的研究*

王娜梅

（河南中醫學院第三臨床醫學院，河南鄭州450008）

·論著·

小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠代謝及生殖作用的研究*

王娜梅

（河南中醫學院第三臨床醫學院，河南鄭州450008）

目的探討小檗堿對多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠代謝及生殖的作用。方法采用皮下注射脫氫表雄酮（DHEA）造模法建立PCOS大鼠模型，將大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、二甲雙胍組和小檗堿組，分別給予相應藥物連續灌胃28 d。用電子精密天平測量脂肪濕重，計算脂體比；全自動生化分析儀測定大鼠血清膽固醇及三酰甘油水平；口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）測定血糖；計算穩態模型胰島素抵抗指數（HOMAIR）。行陰道涂片、蘇木精-伊紅染色法（HE）觀察動情周期；用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）、睪酮（T）、胰島素（INS）水平；行卵巢組織HE染色，光鏡下觀察卵巢組織形態學變化。結果與正常對照組比較，模型對照組大鼠體內脂肪濕重及脂體比增加，血清膽固醇水平明顯升高，糖耐量異常，空腹胰島素及HOMA-IR明顯升高，失去規律的動情周期，血清FSH、LH、T水平升高，卵巢呈多囊樣改變。小檗堿和二甲雙胍可不同程度地改變PCOS大鼠上述病理改變，小檗堿在降低血清膽固醇及脂肪濕重、脂體比方面明顯優于二甲雙胍。結論小檗堿可改善PCOS大鼠糖、脂代謝異常，降低LH、T水平，恢復大鼠動情周期，改善卵巢形態學結構。

多囊卵巢綜合征；小檗堿；糖脂代謝；雄激素

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是最常見的婦科內分泌疾病之一，臨床上以雄激素過高的臨床或生化表現、持續無排卵、卵巢多囊改變為特征，常伴胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和肥胖[1]。改善IR和降低雄激素治療常使患者恢復規律的月經周期和排卵。小檗堿是黃連的主要成分之一，在一千多年中藥史上一直被用于治療糖尿病。小檗堿具有明顯的降糖和降血脂作用，可明顯降低2型糖尿病患者的血糖、血脂水平，療效肯定。除降糖作用外，近年研究發現小檗堿對雄激素合成亦具有明顯作用[2-3]。小檗堿具有降糖、降脂及降雄激素作用，與PCOS的病理改變吻合，為此本研究應用小檗堿對PCOS大鼠模型進行干預治療，觀察其對模式大鼠生殖和代謝的調節作用，為小檗堿的臨床應用提供基礎研究依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物選用23 d齡雌性SD清潔級大鼠60只，體重（50±20）g，由河南省動物實驗中心提供，大鼠許可證號：SCXK（豫）2010-0002。采用獨立通風籠飼養，喂食標準飼料。

1.1.2 主要藥物與試劑脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）購自湖北芳通藥業有限公司（批號：20120518），鹽酸二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司（批號：1207097），鹽酸小檗堿片購自成都錦華藥業有限責任公司（批號：121014），注射用大豆油購自中航（鐵嶺）藥業有限公司（批號：y12080204-3-01），大鼠胰島素（Insulin，INS）酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（批號∶2013032154）、大鼠睪酮（Testosterone，T）ELISA檢測試劑盒（批號∶2013050428）、大鼠促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）ELISA檢測試劑盒（批號∶201306012）及大鼠促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH）ELISA檢測試劑盒（批號：2013060742）購自美國R&D公司，50％葡萄糖注射液購自河南潤弘制藥股份有限公司（批號：1208081）。

1.2方法

1.2.1 動物分組及造模方法60只雌性SD大鼠隨機分為正常對照組（15只）和模型組（45只）。模型組每日頸背部皮下注射DHEA 6 mg/100 g+0.2 ml注射用大豆油，連續20 d；正常對照組每日頸背部皮下注射0.2 ml注射用大豆油，連續20 d，制作PCOS動物模型。造模結束后連續2個性周期（每個性周期4 d）陰道上皮細胞涂片，陰道上皮細胞持續角化，提示無排卵大鼠模型制作成功。

1.2.2 給藥方法造模成功后將模型組大鼠隨機分為模型對照組、小檗堿組和二甲雙胍組，每組15只，每天上午8：00分別給予0.5％羧甲基纖維素鈉溶液、鹽酸小檗堿片300 mg/kg（溶于0.5％羧甲基纖維素鈉溶液）、鹽酸二甲雙胍200 mg/kg（溶于0.5％羧甲基纖維素鈉溶液）灌胃。正常對照組15只大鼠給予0.5％羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。灌胃期間大鼠死亡4只（其中模型對照組死亡2只，二甲雙胍組及小檗堿組各死亡1只）。連續灌胃28 d后，行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）測定大鼠各時間血糖值，行陰道涂片觀察各組大鼠動情周期變化，于動情間期處死大鼠，留取血清待測，留取卵巢組織，4％多聚甲醛固定待測。

1.2.3 觀察內容及方法①動情周期：連續2個周期陰道脫落細胞涂片、蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）觀察大鼠動情周期；②OGTT試驗：大鼠禁食、不禁水12 h，以3 g/kg劑量灌服50％葡萄糖溶液，尾尖取血，血糖儀測定大鼠灌糖后0、30、60及120 min的血糖值；③大鼠體重、體內脂肪濕重及脂體比：分別用電子體重測量儀和電子精密天平測量，計算脂肪濕重（脂肪濕重=卵巢周圍脂肪+腎周圍脂肪+腸系膜周圍脂肪）和脂體比（脂體比=脂肪濕重/體重）；④血脂測定：應用美國貝克曼庫爾特有限公司生產的AU5800型全自動生化分析儀測定血清膽固醇及三酰甘油水平；⑤ELISA法檢測大鼠血清INS、FSH、LH及T水平，計算LH/FSH值；⑥計算穩態模型胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment-insulinresistance，HOMA-IR）：HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mIU/L）/22.5；⑦HE染色觀察大鼠卵巢形態學變化：取大鼠卵巢組織，去除卵巢表面的脂肪組織，4％多聚甲醛溶液固定，酒精逐級脫水，浸蠟包埋，5μm切片，HE染色，光鏡觀察卵巢組織形態學變化。

1.3統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布計量資料多組間比較用單因素方差分析，不符合正態分布的采用對數法或倒數法轉換為正態資料后進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠代謝相關指標的變化

2.1.1 各組大鼠體重、脂肪濕重、脂體比比較與正常對照組比較，模型對照組體內脂肪濕重及脂體比顯著增加（P=0.004和0.048）。與模型對照組比較，二甲雙胍組體內脂肪濕重明顯降低（P=0.024），小檗堿組脂肪濕重及脂體比顯著降低（P=0.002和0.033）。小檗堿組體重較模型對照組有降低趨勢，但各組大鼠體重比較差異無統計學意義。見表1。

2.1.2 各組大鼠血脂水平比較與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清膽固醇水平明顯升高（P=0.006）。與模型對照組比較，小檗堿組血清膽固醇水平明顯降低（P=0.033），二甲雙胍組血清膽固醇水平有降低趨勢。各組血清三酰甘油水平比較差異無統計學意義。見表2。

2.1.3 各組大鼠OGTT血糖比較與正常對照組比較，模型對照組大鼠OGTT試驗0、30和120 min血糖值明顯升高（P=0.000），說明大鼠存在糖耐量異常。與模型對照組比較，二甲雙胍組及小檗堿組OGTT試驗各時間血糖值顯著降低（P=0.000和0.008）。見圖1。

2.1.4 各組大鼠空腹胰島素及HOMA-IR比較與正常對照組比較，模型對照組大鼠空腹胰島素及HOMA-IR明顯升高（P=0.000），說明大鼠存在胰島素抵抗。與模型對照組比較，二甲雙胍組和小檗堿組的空腹胰島素、HOMA-IR水平顯著降低（P=0.000）。與二甲雙胍組比較，小檗堿組空腹胰島素及HOMA-IR水平顯著升高（P=0.038和0.007）。見表3。

2.2各組大鼠生殖相關指標的變化

2.2.1 各組大鼠動情周期的變化連續2個周期的陰道涂片結果顯示，正常對照組大鼠有規律的動情周期（4～5 d）；模型對照組大鼠動情周期延長至8～9 d或無明顯的動情周期，提示無排卵；經小檗堿及二甲雙胍灌胃治療后大鼠恢復規律的動情周期。

2.2.2 各組大鼠性血清FSH、LH、T水平及LH/FSH比較與正常對照組比較，模型對照組血清FSH、LH、T水平顯著升高（P=0.000）。與模型對照組比較，二甲雙胍組及小檗堿組FSH、LH、T水平顯著降低（二甲雙胍組P=0.000；小檗堿組P=0.000、0.007和0.000）；小檗堿組LH及T水平較二甲雙胍組明顯升高（P=0.017和0.000）。各組LH/FSH值比較差異無統計學意義。見表4。

2.2.3 各組大鼠卵巢HE染色光鏡下的形態學變化正常對照組卵巢組織內可見各級卵泡及多個黃體組織，卵泡內卵丘、卵母細胞清晰可見，顆粒細胞呈多層（8～9層）；模型對照組卵巢組織內可見較多呈囊性擴張的卵泡，囊狀卵泡內卵母細胞或放射冠消失，可見多個囊泡，顆粒細胞層數較少（2～3層）、排列疏松，正常形態的各級細胞少見，黃體數目較少；二甲雙胍組卵巢組織內可見極少數囊泡，各級卵泡細胞數量增多，顆粒細胞及黃體數目增多，細胞排列緊密；小檗堿組卵巢組織內可見少數囊泡、各個發育階段的卵泡及較多黃體組織，卵泡內顆粒細胞層數較模型組對照明顯增多，排列整齊；二甲雙胍組及小檗堿組卵巢組織中各級卵泡及黃體數目較模型對照組明顯增多。見圖2。

表1 各組大鼠體重、脂肪濕重、脂體比比較（±s）

表1 各組大鼠體重、脂肪濕重、脂體比比較（±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.01；2）與正常對照組比較，P＜0.05；3）與模型對照組比較，P＜0.05；4）與模型對照組比較，P＜0.01

組別例數體重/g脂肪濕重/g脂體比正常對照組15270.93±27.552.50±0.380.009 3±0.001 3模型對照組13288.69±29.503.00±0.411）0.010 4±0.001 32）二甲雙胍組14274.57±28.702.61±0.493）0.009 5±0.001 4小檗堿組14271.71±22.962.36±0.454）0.008 8±0.001 83）

表2 各組大鼠血清膽固醇、三酰甘油比較（mmol/L±s）

表2 各組大鼠血清膽固醇、三酰甘油比較（mmol/L±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.01；2）與模型對照組比較，P＜0.01

組別例數膽固醇三酰甘油正常對照組151.73±0.260.74±0.22模型對照組131.99±0.211）0.79±0.20二甲雙胍組141.86±0.240.82±0.20小檗堿組141.79±0.232）0.71±0.17

圖1 各組大鼠OGTT血糖比較

表3 各組大鼠空腹胰島素及HOMA-IR比較（±s）

表3 各組大鼠空腹胰島素及HOMA-IR比較（±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.01；2）與模型對照組比較，P＜0.01；3）與二甲雙胍組比較，P＜0.05；4）與二甲雙胍組比較，P＜0.01

組別例數空腹INS/（mU/L）HOMA-IR正常對照組159.44±2.052.19±0.46模型對照組1332.17±3.461）13.99±2.991）二甲雙胍組149.93±2.412）2.21±0.522）小檗堿組1412.01±2.312）3）2.89±0.692）4）

表4 各組大鼠血清FSH、LH、T水平及LH/FSH比較（±s）

表4 各組大鼠血清FSH、LH、T水平及LH/FSH比較（±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.01；2）與模型對照組比較，P＜0.01；3）與二甲雙胍組比較，P＜0.05；4）與二甲雙胍組比較，P＜0.01

組別例數FSH/（mIU/ml）LH/（mIU/ml）T/（pg/ml）LH/FSH正常對照組155.26±0.8319.55±2.10157.55±17.663.83±0.84模型對照組139.75±0.881）38.23±4.161）298.10±31.621）3.96±0.63二甲雙胍組147.09±0.742）29.62±4.502）185.49±24.522）4.24±0.85小檗堿組147.58±1.072）32.94±3.202）3）225.20±19.152）4）4.40±0.54

圖2 各組大鼠卵巢組織切片（HE×200）

3 討論

PCOS是常見的女性內分泌失調性疾病，病因不清，發病機制尚未闡明。臨床上PCOS主要表現為糖、脂代謝異常和生殖功能障礙并存，長期發展可引起糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、高血脂及子宮內膜癌等遠期代謝并發癥，嚴重影響婦女生殖健康和生活質量。PCOS患者的代謝異常主要表現為IR和高胰島素血癥；PCOS患者的生殖功能障礙主要表現為卵巢排卵功能障礙和雄激素分泌過多[4]。PCOS患者亦常常存在血脂代謝異常。一項臨床回顧分析研究表明，PCOS患者IR的發生率為38.1％，血脂異常的發生率為24.7％，血脂異常與IR呈正相關。臨床上可使用胰島素增敏劑改善IR，從而改善PCOS患者的血脂代謝異常[5]。肥胖尤其是中心性肥胖及高雄激素血癥，與PCOS血脂異常的發生亦密切相關。本研究結果顯示，模型對照組大鼠動情周期延長或無明顯的動情周期，呈無排卵狀態；血清FSH、LH、T水平升高，呈高雄激素、高LH水平狀態；卵巢呈多囊樣變；模型對照組大鼠存在糖耐量異常，空腹胰島素及HOMA-IR明顯高于正常對照組；模型對照組大鼠血清膽固醇水平明顯升高，體內脂肪濕重及脂體比較正常對照組顯著增加，提示大鼠存在IR、脂代謝異常及生殖功能障礙。說明本模型是研究PCOS生殖及代謝異常的較理想的動物模型。

目前PCOS治療以藥物治療為主，并提倡生活方式的調整，如控制飲食、運動及減輕體重。鑒于IR在PCOS發病中的重要作用，臨床上給予IR的PCOS患者胰島素增敏劑。改善IR后，常常可使患者雄激素水平下降，月經周期好轉甚至正常，排卵率增加。本研究中二甲雙胍顯示較好的改善PCOS大鼠糖耐量異常、降低胰島素、改善大鼠IR及降低大鼠LH、T水平的作用，并可恢復大鼠動情周期，改善卵巢多囊狀態。目前臨床應用的胰島素增敏劑主要有雙胍類和噻唑烷二酮類。兩者的療效確切，但是不良反應重且價格較貴，不利于患者長期應用。因此，尋找一種針對PCOS治療的安全、經濟、有效的藥物是臨床亟待解決的問題。

小檗堿是從傳統中藥黃連根莖中提取的異喹啉類生物堿，屬季銨類化合物。近年來研究表明，小檗堿除具有傳統的抗菌消炎的作用外，還能夠改善IR，降低血糖，降血脂，增加胰島素敏感性而用于2型糖尿病的治療，且無明顯不良反應。小檗堿的作用特點和二甲雙胍類似，屬胰島素增敏劑，臨床可用于糖耐量異常和輕度高血糖患者。相關實驗研究中，小檗堿可明顯降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠空腹血糖水平，改善糖耐量異常，降低血清膽固醇及三酰甘油水平[6]。最近一項臨床研究表明，小檗堿可明顯降低PCOS患者空腹血糖、空腹胰島素水平，增強胰島素敏感性，并且可明顯減低PCOS患者血脂水平[7]。也有研究表明，小檗堿能顯著改善PCOS患者的向心性肥胖，調節血脂，減輕體重，改善高胰島素血癥，增加胰島素敏感性，并可改善慢性炎癥[8-9]。在本研究中，PCOS大鼠經灌胃治療后，小檗堿可明顯降低模型大鼠體內脂肪濕重，降低脂體比，降低大鼠血清膽固醇水平，改善大鼠糖耐量異常狀態，降低空腹胰島素水平，改善大鼠IR，顯示較好的降脂、降糖作用。其降糖作用與二甲雙胍組相似，但其降低空腹胰島素及胰島素抵抗指數效果稍遜于二甲雙胍，而其降低血清膽固醇、脂肪濕重及脂體比作用明顯優于二甲雙胍。小檗堿降糖機制目前仍不清楚，可能是通過活化腺苷酸活化蛋白激酶信號分子起降糖作用，也可能是通過調節胰島素信號通路上的關鍵分子，包括胰島素受體底物1、磷脂酰肌醇3激酶P85亞基、蛋白激酶B、葡萄糖轉運蛋白4等而起到降糖作用[10-11]。有研究表明，小檗堿通過調節胰島素受體的表達而降血糖，該調節是蛋白激酶C依賴性的[12]。

除降糖作用外，近年研究發現，小檗堿對雄激素合成亦具有明顯降低作用。小檗堿可逆轉地塞米松誘導的胰島素抵抗卵泡膜細胞雄激素合成的增加及葡萄糖攝取的減弱[13]。小檗堿對雄激素受體信號通路有抑制作用[14]。本研究中，小檗堿可明顯降低PCOS大鼠血清T水平，進一步在動物身上體現小檗堿的降雄激素作用。除降雄激素作用外，本研究顯示，小檗堿對PCOS大鼠高LH水平亦有明顯降低作用，可改善大鼠內分泌失調狀態。小檗堿治療后，經2個周期陰道涂片發現大鼠恢復規律的動情周期，在卵巢形態學改變方面黃體數目增多，各級卵泡數目增多，囊泡數目減少，可能是小檗堿改善大鼠糖脂代謝異常、改善高雄激素、IR等異常內分泌狀態，使大鼠整體內分泌功能趨于正常，從而卵巢形態學趨于正常，使大鼠恢復規律的動情周期及排卵。

綜上所述，小檗堿可改善PCOS大鼠糖脂代謝異常，降低T及LH水平，改善大鼠內分泌失調狀態及卵巢形態學結構，使大鼠恢復規律的動情周期，從而使大鼠生殖功能趨于正常。由于實驗條件的限制，其作用的相關分子機制有待進一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Effect of Berberine on metabolism and reproduction in rats with polycystic ovarian syndrome*

Na-mei WANG
(The Third Affiliated Hospital,Henan College of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450008,P.R.China)

【Objective】To study the effect of Berberine on metabolism and reproduction in rats with polycystic ovarian syndrome(PCOS).【Methods】PCOS rat model was established by subcutaneous injection of DHEA.Rats were randomly divided into 4 groups:normal control group,model control group,Metformin group and Berberine group.Wet weight of fat in the four groups was measured with electronic precision balance.Serum cholesterol and triglyceride levels were detected by automatic biochemical analyzer,and blood glucose was detected using oral glucose tolerance test(OGTT).Estrous cycles were observed by vaginal smear and HE staining method.Follicle stimulating hormone(FSH),luteinizing hormone(LH),testosterone(T)and insulin levels were detected by ELISA.Ovarian morphology was observed using HE staining and light microscopy.【Results】Compared with the normal control group,the wet weight of fat in the model control group significantly increased.Cholesterol,fasting insulin,HOMA-IR,FSH,LH and T levels of the model control group were markedly higher than those of the normal control group.Rats in the model control group had polycystic ovaries,abnormal glucose tolerance and irregular estrus cycles.Berberine and Metformin ameliorated the above pathological changes of PCOS rats to different degree.Berberine had better effects on lowering serum cholesterol and body fat than Metformin.【Conclusions】Berberine can improve glucose and lipid metabolism,reduce LH and T levels,restore estrus cycle and improve ovarian morphology in PCOS rats.

polycystic ovarian syndrome;Berberine;glucose and lipid metabolism;androgen

R711.75；R271.9

A

1005-8982（2015）35-0013-05

2015-06-15

河南中醫學院博士科研基金（No：BSJJ2010-32）