黃芩素對結腸癌SW480細胞增殖與凋亡的影響

王寧，暢靈麗，程琦，張延新

（漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南漯河462000）

·論著·

黃芩素對結腸癌SW480細胞增殖與凋亡的影響

王寧，暢靈麗，程琦，張延新

（漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南漯河462000）

目的探討黃芩素對人結腸癌SW480細胞增殖與凋亡的影響及可能的機制。方法噻唑藍（MTT）法檢測黃芩素對SW480細胞增殖的影響，Hoechst 33258染色觀察黃芩素處理后細胞的形態學改變，流式細胞術檢測其對SW480細胞的凋亡誘導作用，比色法檢測黃芩素作用后細胞Caspase-3活性的變化。結果黃芩素能夠抑制SW480細胞增殖，呈劑量、時間依賴性。150μmol黃芩素作用SW480后，細胞出現明顯的凋亡形態學改變。流式細胞術檢測表明，150μmol黃芩素作用細胞后引起的凋亡率顯著高于對照組（P＜0.01）。黃芩素可以提高細胞Caspase-3活性并呈劑量依賴性。結論黃芩素可以抑制SW480細胞增殖，并可能通過Caspase-3依賴性通路誘導凋亡。

黃芩素；結腸腫瘤；SW480細胞；細胞凋亡

結腸癌已成為一種日益嚴重的健康問題，是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一。特別是在歐美等發達國家，其已成為癌癥患者高死亡率的主要原因之一[1-3]。在我國惡性腫瘤患者中，結腸癌的發病率僅次于肺癌和胃癌，位居第3位，死亡率位居第5位[4]。

黃芩屬唇形科黃芩屬植物，為多年生草本植物，以干燥根入藥，是常用的傳統中藥之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌及抗炎活性[5-7]。黃芩素是黃芩根中的主要黃酮類化學成分。有研究表明，黃芩素能抑制膠質瘤和骨髓瘤細胞生長及誘導細胞凋亡[8-9]。目前，黃芩素對結直腸腫瘤細胞的影響及作用機制還不十分清楚。本實驗以人結腸癌細胞系SW480為研究對象，觀察黃芩素對SW480細胞的生長抑制和誘導細胞凋亡的作用，探討黃芩素在結腸癌中的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芩素、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（商品名：噻唑藍）[3-（4，5-dimethylthi ahiazo-z-y1）-2，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]和Hoechst33258購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC kit購自德國Calbiochem公司；無血清細胞凍存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司，Caspase-3檢測試劑盒購自美國BioVision公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人結腸癌細胞系SW480購于上海生物研究所，來源為人結腸低分化黏液腺癌。SW480細胞常規培養于含10％小牛血清的DMEM培養基，放置在37℃、5％二氧化碳CO2培養箱中。經胰蛋白酶消化、傳代，收集對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖抑制率取收集對數生長期的SW480細胞，常規消化制備單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104個/ml，將細胞懸液以200μl/孔接種于96孔板，5％CO2、37℃培養24 h。將實驗分為4組，前3組分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50和100μmol，第4組為空白對照組，繼續培養12、24、36、48和72 h后每孔加入濃度為5 mg/ml MTT溶液10μl，孵育4 h后終止，振蕩15 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度光密度（optical density，OD）值，并按照以下公式計算細胞生長抑制率（inhibition rate，IR）：IR=（1-空白組OD值/實驗組OD值）×100％。根據抑制率曲線擬合48 h濃度與抑制率曲線，計算半數抑制濃度IC50。實驗重復3次。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察細胞形態將單細胞懸液接種于6孔板，5％CO2、37℃培養24 h，加入黃芩素溶液并使其最終濃度為100μmol，設立空白對照組，繼續培養48 h后，將細胞固定在4％多聚甲醛中10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次，加入0.5 ml濃度為10μg/ml Hoechst 33258染色液，5 min后棄去染液并用PBS清洗2次。染色后用熒光倒置顯微鏡進行觀察。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡調整SW480細胞濃度為5×104個/ml，2 ml/孔接種于6孔板中。待細胞貼壁后，分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50和100μmol，設立空白對照組，繼續培養48 h。胰酶消化后，4℃、300×g離心5 min，棄上清液，收集細胞。PBS清洗2次后，加入100μl 1×Binding Buffer重懸細胞，再加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，混勻、避光，室溫反應10 min。加入400μl 1×Binding Buffer，混勻。經流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Caspase-3活性檢測收集SW480對數期細胞，調整細胞濃度接種于100 mm培養皿中，培養24 h后分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50和100μmol，設立空白對照組，繼續培養12、24、48和72 h。收集細胞，100×g離心后棄上清液，加入細胞裂解液，充分混勻，冰上裂解20 min后離心，將上清液移入新的離心管并放置冰上，測定各樣品的蛋白濃度。取等量的樣品接種于96孔板，每孔加入50μl 2×反應液及5μl濃度為4mmol顯色反應底物，混勻后37℃孵育1h。在405nm處測定其OD值。對照組計算值設定為100％，實驗組值=實驗組OD值/對照組OD值×100％。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析來進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 不同濃度黃芩素對SW480細胞的生長抑制作用

2.1MTT比色法分析細胞生長的抑制作用

體外實驗表明，黃芩素對SW480細胞有直接抑制作用，并呈現劑量、時間依賴性（見圖1）。作用48 h后，100μmol濃度的黃芩素對細胞的抑制作用最明顯，達51.32％，與其他處理組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）（見表1）。72h檢測細胞抑制率低于48h，但相同濃度下72 h與48 h抑制率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。根據擬合曲線計算其半數抑制濃度IC50=93.51μmol。

2.2 SW480細胞的形態學變化

100μmol黃芩素作用SW480細胞48 h，經10μg/ml Hoechst 33258染色處理5 min后，與對照組細胞比較，熒光顯微鏡可觀察到黃芩素處理組的細胞核中染色質凝集、固縮，形成明顯的凋亡小體。見圖2。

表1 不同濃度黃芩素對SW480細胞增殖的抑制率（s）

表1 不同濃度黃芩素對SW480細胞增殖的抑制率（s）

黃芩素12 h24 h36 h48 h72 h 25μmol4.55±2.3510.13±2.3714.19±3.0219.38±4.3816.89±4.95 50μmol7.06±1.1216.32±2.7222.83±3.4930.52±5.3329.88±5.64 100μmol12.05±3.4925.88±3.5635.63±4.0751.32±4.4345.72±7.03P值（25μmol vs 50μmol）0.1700.0410.0320.0490.040P值（50μmol vs 100μmol）0.0780.0210.0140.0070.038P值（25μmol vs 100μmol）0.0370.0030.0020.0020.004

圖2 黃芩素作用48 h后SW480細胞的形態學變化（×400）

2.3各組SW480細胞的凋亡

圖3 流式細胞術檢測黃芩素作用于SW480細胞的凋亡結果

表2 不同濃度黃芩素對SW480細胞Caspase-3活性的影響（±s）

表2 不同濃度黃芩素對SW480細胞Caspase-3活性的影響（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.01

組別12 h24 h48 h72 h Caspase-3活性Caspase-3活性Caspase-3活性Caspase-3活性P值對照組100±00.419138±210.0351）122±250.202107±200.577 25μmol組113±250.0421）285±240.0002）213±160.0002）145±200.0181）50μmol組153±310.0012）395±330.0002）352±360.0002）321±410.0002）100μmol組252±290.419138±210.0351）122±250.202107±200.577P值P值P值

不同濃度的黃芩素作用SW480細胞48 h后，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率。對照組、25、50和100μmol黃芩素處理組的凋亡率分別為（4.43±1.82）％、（5.57±2.19）％、（9.01±1.56）％和（14.89±2.04）％。與對照組比較，50μmol黃芩素處理組凋亡率升高，差異有統計學意義（P=0.029）；100μmol黃芩素處理組凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P=0.003）。見圖3。

2.4凋亡相關Caspase-3活性

黃芩素作用SW480細胞后，Caspase-3活性隨著時間延長呈上升趨勢，24 h后下降，各組趨勢一致。但與對照組比較，25μmol組Caspase-3活性變化不明顯；50和100μmol組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

細胞增殖和凋亡調控的紊亂與惡性腫瘤的發生、發展關系密切。抑制腫瘤細胞的過度增殖，選擇性誘導腫瘤細胞凋亡是治療惡性腫瘤的一個方向[10]。治療上可以通過增加誘導凋亡基因的表達和抑制抗凋亡基因的表達來實現。本研究分析來自于黃芩的一種黃酮類化合物——黃芩素的抗腫瘤作用，將不同濃度的黃芩素作用于人結腸癌SW480細胞并進行培養，通過MTT比色、形態學變化及流式細胞術檢測細胞的增殖凋亡。

有研究表明，黃芩素能夠通過不同途徑抑制各種腫瘤細胞的生長并誘導其發生凋亡。黃芩素能夠抑制肝癌細胞的增殖并誘導細胞的凋亡[11]。黃芩素通過抑制胃癌細胞血管內皮生長因子和肝細胞生長因子的表達來抑制胃癌細胞的增殖與凋亡[12]。黃芩素在20～120μmol濃度下能夠顯著抑制人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的生長[13]。黃芩素呈劑量、時間依賴性抑制人胰腺癌PANC-1細胞增殖，影響腫瘤細胞偽足的形成，導致細胞的侵襲力下降[14]。黃芩素通過抑制人乳腺癌細胞富含AT序列的特異結合蛋白1基因的表達，發揮其抑制乳腺癌細胞生長的作用[15]；黃芩素經Caveolin-1/AKT/mTOR途徑抑制人前列腺癌細胞的生長及侵襲[16]。

本研究表明，黃芩素能夠明顯抑制人結腸癌SW480細胞的增殖，并呈劑量、時間依賴性，而實驗中筆者觀察到不同濃度黃芩素處理組72 h細胞抑制率相對48 h出現下降，但兩者差異無統計學意義。根據對照組腫瘤細胞的生長曲線，發現72 h后細胞生長速度下降，分析出現該現象的原因可能與腫瘤細胞生長以及對藥物敏感性下降有關，但具體機制需進一步研究證實。在顯微鏡下可以觀察到黃芩素處理組腫瘤細胞發生細胞核中染色質凝集的形態學改變，提示在體外實驗中黃芩素可能誘導結腸腺癌細胞發生凋亡。為進一步驗證黃芩素促凋亡作用，本實驗通過流式細胞術檢測凋亡細胞所占的比例，100μmol濃度黃芩素處理組的細胞凋亡比例顯著高于對照組（P＜0.01），進一步提示黃芩素能夠促進人結腸癌SW480細胞的凋亡。

Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族是參與凋亡進程的兩個蛋白家族，前者負責凋亡的執行，后者調控線粒體的完整性[17]。目前已確定哺乳動物有14種Caspase酶類。其中Caspase-3屬于凋亡調控下游環節的剪切酶，可通過作用于多種底物，參與細胞凋亡的調控[16]。已有研究表明，Caspase-3表達率降低與喉癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、直腸癌等惡性腫瘤的發生、發展有關[18]。

黃芩素可以促進SW480細胞的Caspase-3活性增加，提示黃芩素可能通過Caspase-3依賴性信號通路來發揮促凋亡作用。

黃芩素作為來源于傳統中藥黃芩的天然化合物，在抗炎、抗腫瘤方面起一定的作用，臨床應用潛力大，但黃芩素的抗腫瘤詳細機制還不清楚，需要進一步研究。

[1]FERLAY J,STELIAROVA-FOUCHER E,LORTET-TIEULENT J,et al.Cancer incidence and mortality patterns in Europe∶estimates for 40 countries in 2012[J].Eur J Cancer,2013,49(6)∶1374-1403.

[2]MUNRO AJ.Comparative cancer survival in European countries[J].Br Med Bull,2014,110(1)∶5-22.

[3]TARVER T.American cancer society cancer facts and figures 2014[J].Journal of Consumer Health on the Internet,2012,16(3)∶366-367.

[4]陳萬青,張思維,鄭榮壽,等.中國2009年惡性腫瘤發病和死亡分析[J].中國腫瘤,2013,1∶2-12.

[5]RAZINA TG,UDINTSEV SN,TIUTRIN II,et al.The role of thrombocyte aggregation function in the mechanism of the antimetastatic action of an extract of baikal skullcap[J].Vopr Onkol,1989,35(3)∶331-335.

[6]MAHMOOD N,PIZZA C,AQUINO R,et al.Inhibition of HIV infection by flavanoids[J].Antiviral Res,1993,22(2/3)∶189-199.

[7]KUBO M,KIMURA Y,ODANI T,et al.Studies on scutellariae radix.PartⅡ∶the antibacterial substance[J].Planta Med,1981,43(2)∶194-201.

[8]KYO R,NAKAHATA N,SAKAKIBARA I,et al.Baicalin and baicalein,constituents of an important medicinal plant,inhibit intracellular Ca2+elevation by reducing phospholipase C activity in C6 rat glioma cells[J].J Pharm Pharmacol,1998,50(10)∶1179-1182.

[9]MA Z,OTSUYAMA K,LIU S,et al.Baicalein,a component of scutellaria radix from huang-lian-jie-du-tang(HLJDT),leads to suppression of proliferation and induction of apoptosis in human myeloma cells[J].Blood,2005,105(8)∶3312-3318.

[10]GREENDR,GALLUZZIL,KROEMERG.Cellbiology.Metabolic control of cell death[J].Science,2014,345(6203)∶1446.

[11]向淼,徐細明,鄧君健,等.黃芩素誘導人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡作用的研究[J].現代腫瘤醫學,2012,6∶1098-1103.

[12]張偉,劉寬浩.黃芩素對胃癌細胞VEGF和HGF表達的影響[J].現代預防醫學,2011,11∶2135-2137.

[13]徐維恒,肖雷,馬宜明.黃芩素對乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231增殖的影響[J].中國藥師,2011,1∶26-28.

[14]任學群,李宜雄.黃芩素對人胰腺癌PANC-1細胞增殖和運動能力的影響[J].河南大學學報（醫學版）,2010,3∶180-185.

[15]GAO XY,XUE XH,MA YN,et al.Effect of baicalein on the expression of SATB1 in human breast cancer cells[J].Experimental and Therapeutic Medicine,2015,9(5)∶1665-1669.

[16]GUO Z,HU X,XING Z,et al.Baicalein inhibits prostate cancer cell growth and metastasis via the caveolin-1/Akt/mTOR pathway[J].Mol Cell Biochem,2015,406(1/2)∶111-119.

[17]MCILWAIN D,BERGER T,MAK TW.Caspase functions in cell death anddisease[J].ColdSpring HarbPerspect Biol,2013,DOI∶10.1101/cshperspect.a026716.

[18]MAZUMDER S,PLESCA D,ALMASAN A.Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J].Methods Mol Biol,2008,414∶13-21.

（申海菊 編輯）

Effect of Baicalein on proliferation and apoptosis of SW480 cell line

Ning WANG,Ling-li CHANG,Qi CHENG,Yan-xin ZHANG
(Department of Basic Medical Science,Luohe Medical College,Luohe,Henan 462000,P.R.China)

【Objective】To study the effects of Baicalein on proliferation and apoptosis in human colon carcinoma cell line SW480,and to explore the apoptosis mechanism.【Methods】The effect of Baicalein on the proliferation of SW480 was detected by MTT analysis.The morphological manifestation of SW480 cells stained by Hoechst 33258 was investigated with fluorescence microscopy after the cells were treated with Baicalein for 48 hours.Apoptosis was also examined by flow cytometry.Variation regularity of the activity of caspase-3 was detected with the test kit.【Results】Baicalein significantly inhibited SW480 proliferation in a dose-and time-dependent manner.The characteristic morphological changes of apoptosis were observed under microscopy in SW480 cells treated with 150 μmol of Baicalein.It showed that the apoptosis rate in the group of 150 μmol Baicalein was significantly higher than that in the control group(P＜0.01).Baicalein promoted the activity of caspase-3 in SW480 cells in a dose-dependent manner.【Conclusions】Baicalein can inhibit the proliferation of SW480 cells and induce cell apoptosis through the caspase-3 dependent pathway.

Baicalein;colonic neoplasm;SW480;apoptosis;caspase-3

R735.35

A

1005-8982（2015）35-0022-05

2015-03-19