大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2在結腸癌中的表達及臨床意義

廖真，寧輝，劉偉，蘆偉

（湖北省恩施州來鳳縣中心醫院普外胸外科，湖北恩施445700）

·論著·

大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2在結腸癌中的表達及臨床意義

廖真，寧輝，劉偉，蘆偉

（湖北省恩施州來鳳縣中心醫院普外胸外科，湖北恩施445700）

目的檢測大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2（RASAL2）在結腸癌組織中的表達，探討其與結腸癌臨床病理特征的相關性及意義。方法應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、蛋白質印跡及免疫組織化學法檢測RASAL2在42例結腸癌及其癌旁組織中的表達，分析其與結腸癌臨床病理特征的相關性。結果qRT-PCR及蛋白質印跡檢測顯示，RASAL2在結腸癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織（P＜0.05）；免疫組織化學法染色結果顯示，RASAL2在結腸癌組織中的高表達率明顯低于癌旁組織（42.9％vs 88.1％，χ2=19.012，P＜0.01），且RASAL2的表達與腫瘤的Dukes分期、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。結論RASAL2在結腸癌中的低表達可能與腫瘤的發生、發展和浸潤轉移等惡性生物學行為相關。

大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2；結腸癌；實時熒光定量聚合酶鏈反應；蛋白質印跡；免疫組織化學法

在我國，隨著人們生活水平的提高和膳食結構的改變，結腸癌的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅國人的生命健康。目前研究認為，癌基因激活及抑癌基因失活與腫瘤的發生、發展密切相關。大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）是由Ras基因編碼且具有鳥苷三磷酸酶活性，其在包括結腸癌在內的多種人類腫瘤中存在異常突變，并廣泛參與腫瘤的惡性生物學進程，是最為重要的原癌基因之一[1-2]，大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2（rat sarcoma protein activator like 2，RASAL2）是一種大鼠肉瘤三磷酸鳥苷（rat sarcoma guanosine triphosphate，RasGTP）酶活性蛋白，其能加快RasGTP酶的活性，關閉Ras信號通路，實施負性調控[3]，現有研究表明，RASAL2在乳腺癌、星形細胞瘤、卵巢癌及肺癌中表達下降，并具有潛在的腫瘤抑制作用[4-7]。目前，關于RASAL2在結腸癌中的研究尚未見報道，本研究通過多種分子生物學方法檢測RASAL2在結腸癌中的表達，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1標本材料

選取2012年6月-2014年6月本院診斷為結腸癌并行手術切除患者的組織標本共42例，所有標本經病理確診。其中男性30例，女性12例；中位年齡58.5歲。腫瘤位于近段結腸26例，遠端結腸16例。按Duke病理分期：A期12例，B期7例，C期20例，D期3例。按分化程度：高分化10例，中分化18例，低分化14例。按浸潤深度：侵及漿膜者29例，未侵及漿膜者13例。經病理證實有淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移20例。同期腫瘤切除后距腫瘤邊緣＞5 cm的腸管黏膜為癌旁組織，所有標本在手術切除后立即置于液氮中低溫保存。所有病例術前未行放射治療或化學治療。42例標本常規行石蠟包埋，另取其中12例新近收集的組織（包括癌及癌旁組織）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白質印跡檢測。

1.2主要試劑

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RASAL2及GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，兔抗人RASAL2多克隆抗體購自英國Abcam公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech公司，免疫組織化學鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 qRT-PCR按Trizol說明書提取組織樣品總RNA，按逆轉錄試劑盒（Rever Tra Ace qPCR-RT kit，日本TOYOBO公司）說明書二步法合成cDNA，產物保存于-80℃。根據qRT-PCR試劑盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix，日本TOYOBO公司）說明書在熒光定量PCR儀（ABI7500）上進行檢測。RASAL2正向引物序列為：5'-TGGGCCGAGAGC TTTCAGTTTTGC-3'，反向引物序列為：5'-TTGCCAC GGTCGCCTGTAGGA-3'；GAPDH正向引物序列為5'-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，反向引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'。樣本中目的基因與內參基因（GAPDH）循環閾值的差異為ΔCT，實驗樣本與對照樣本（正常腸管黏膜組織）ΔCT的差異為ΔΔCT，以2-ΔΔCT表示基因的相對表達量，以上實驗重復3次.

1.3.2 蛋白質印跡檢測提取組織中的總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白濃度。30μg蛋白/泳道上樣，10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳、轉膜。5％脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入RASAL2一抗（1∶800）和GAPDH一抗（1∶5 000）于雜交袋中4℃孵育過夜，含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（tris buffered saline with tween，TBST）洗膜后二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h。采用增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）法于凝膠成像系統（Bio-rad）拍照，然后用圖像分析軟件Image J進行灰度分析，計算目的蛋白與GAPDH的光密度比值。

1.3.4 免疫組織化學染色所有標本用中性福爾馬林溶液固定，常規石蠟包埋，連續4μm厚切片。RASAL2一抗的工作濃度為1∶100，操作步驟按照即用型免疫組織化學SABC檢測試劑盒說明書進行，用已知陽性的結腸癌切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。免疫組織化學染色由2位高年資病理科醫生以盲法觀察確定，RASAL2主要為胞漿著色，按照參照文獻[8]的判定標準，每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野（每個視野計數100個細胞），計算陽性細胞百分率及染色程度，以陽性細胞百分數及細胞染色程度評分的乘積進行綜合判斷。陽性細胞數＜5％為0分，5％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分；不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分，結果判定總分≤3為低表達，總分＞3為高表達。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，計數資料以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1RASAL2 mRNA在結腸癌及癌旁組織中的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，在12對結腸癌組織中有10對（83.3％）癌旁組織的RASAL2 mRNA表達水平高于對應的癌組織（見圖1A）；以癌旁組織和癌組織的均值作箱形圖，兩者RASAL2 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P=0.009）（見圖1B）。

2.2蛋白質印跡檢測

12對結腸癌組織中有10對（83.3％）癌旁組織的RASAL2蛋白（129kD）表達量高于對應的癌組織，差異有統計學意義（P=0.006）。見圖2。

圖1 qRT-PCR檢測結腸癌和癌旁組織中RASAL2 mRNA的表達

2.3RASAL2蛋白在結腸癌及癌旁組織中的表達

圖2 蛋白質印跡檢測12對結腸癌和癌旁組織中RASAL2蛋白的表達

圖3 免疫組織化學法檢測RASAL2蛋白在結腸癌和癌旁組織中的表達（SABC×200）

免疫組織化學法染色結果顯示，RASAL2在所有癌旁及大部分癌組織中有表達，主要定位于胞漿，呈棕黃色顆粒狀分布（見圖3）。42例結腸癌組織中RASAL2高表達率為42.9％（18/42），而癌旁組織中RASAL2高表達率為88.1％（37/42），差異有統計學意義（χ2=19.012，P＜0.01）。

2.4RASAL2蛋白表達與結腸癌臨床病理特征的相關性

統計學分析發現，RASAL2蛋白表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小及分化程度等無關（P＞0.05）；而與腫瘤的Dukes分期、浸潤深度和淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見附表。

附表 結腸癌臨床病理特征與RASAL2蛋白表達的相關性

3 討論

結腸癌常常起病隱匿且發展快，確診為早期階段結腸癌5年生存率＞90％，當有局部淋巴結轉移時下降為65％，而有遠處轉移時則＜10％[9]。這表明侵襲轉移是導致結腸癌治療失敗的最主要原因，也是患者致死和影響長期存活的主要因素。目前，研究認為結腸癌的侵襲轉移是一個多基因改變和多因素參與的復雜過程，其中癌基因的激活及抑癌基因功能失活在該過程中占主要地位[10-11]。

Ras基因包括H-Ras、K-Ras和N-Ras 3種，K-ras是目前已知最常被激活的原癌基因之一，其基因突變在結腸癌侵襲轉移過程中發揮極為重要的作用[12-13]。而最新研究表明，Ras蛋白過度活化及其下游信號通路的調節異常可能與Ras基因抑制物Ras GAP的下調或缺失有關[14-15]。RASAL2是Ras GAPs家族的主要成員之一，近期研究發現其能通過多種途徑抑制腫瘤侵襲轉移，是潛在的抑癌基因，MCLAUGHLIN等[4]報道RASAL2在原發性乳腺癌中顯著低表達，且低表達與患者的預后不良相關。而無論是在乳腺癌細胞系還是動物模型中，抑制RASAL2能激活Ras，從而促進腫瘤的侵襲轉移。WEEKS等[5]發現在星形細胞瘤中，RASAL2與上皮細胞轉化因子2相互作用共同調節Rho激酶活性，而下調RASAL2表達則會導致星形細胞瘤的惡性轉化。在卵巢癌的研究中，HUANG等[6]同樣發現RASAL2在腫瘤中表達下調，且與卵巢癌的臨床分期及病理分型相關，而RASAL2敲除后能通過活化大鼠肉瘤-細胞外信號調節激酶通路引起卵巢癌細胞發生上皮間質轉換，促進腫瘤的侵襲轉移。相似的研究結果也在肺癌中被報道[7]。值得注意的是，最新研究發現RASAL2在三陰性乳腺癌中表達上調，且其通過激活Rac1來促進腫瘤的惡性生物學進程，而這種效應并不依賴于Ras GAP酶的催化活性[16]。提示RASAL2在腫瘤中的作用可能與細胞類型及發育背景相關。

目前國內外尚未見RASAL2在結腸癌中的研究報道。本研究結果顯示，RASAL2在結腸癌組織中的表達水平較癌旁組織明顯減少，提示在結腸癌中RASAL2的活性受到抑制。此外，本研究還發現RASAL2蛋白的表達與結腸癌的Dukes分期、浸潤深度及淋巴結轉移呈負相關，提示RASAL2可能在結腸癌的進展及侵襲轉移過程中發揮重要作用，這與上述研究結果相似。

綜上所述，本研究首次發現RASAL2在結腸癌組織中表達下調，且與腫瘤進展及浸潤轉移相關，其中浸潤轉移是影響結腸癌患者預后的重要因素。因此，RASAL2也可能成為結腸癌的一個預后判斷指標，指導患者的預后生存。但目前RASAL2在腫瘤中所扮演的角色及調控機制還不完全清楚，其在結腸癌中的作用及機制有待進一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Clinicopathological significance of expression of Ras protein activator like 2 in colon cancer

Zhen LIAO,Hui NING,Wei LIU,Wei LU
(Department of General and Thoracic Surgery,Central Hospital of Laifeng County,Enshi,Hubei 445700,P.R.China)

【Objective】To evaluate the expression of Ras protein activator like 2(RASAL2)in human colon carcinoma and the corresponding adjacent non-tumor tissues,and to explore the correlation between RASAL2 expression and clinicopathologic characteristics of colon carcinoma.【Methods】The expressions of RASAL2 mRNA and protein in the tumor tissues of 42 cases with colon carcinoma and the corresponding adjacent non-tumor tissues were detected by quantitative real-time PCR,Western blot and immunohistochemistry.The correlation between RASAL2 expression and clinicopathologic characteristics of colon carcinoma was then analyzed.【Results】Quantitative real-time PCR and Western blot analysis showed that the expressions of RASAL2 mRNA and protein in the colon carcinoma tissues were notably lower than those in the corresponding adjacent non-tumor tissues(P＜0.05).Immunohistochemical staining demonstrated that the positive rate of RASAL2 protein expression in the colon carcinoma tissues was significantly lower than that in the adjacent non-tumor tissues(42.9％vs 88.1％;χ2=19.012,P＜0.01),and the expression level of RASAL2 was closely correlated with Dukes stage,invasive depth and lymph node metastasis(P＜0.05).【Conclusions】RASAL2 is down-regulated in colon carcinoma tissues;and it may be involved in the carcinogenesis,development and metastasis of colon carcinoma.

RASAL2;colon cancer;qRT-PCR;Western blot;immunohistochemistry

R735.35

A

1005-8982（2015）35-0043-005

2015-06-30

蘆偉，E-mail：weilu_18@163.com