維生素D受體基因BsmⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病的相關(guān)性研究*

王珍珍，王學(xué)梅，嚴(yán)媚，劉玉

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，新疆烏魯木齊830054）

·臨床論著·

維生素D受體基因BsmⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病的相關(guān)性研究*

王珍珍，王學(xué)梅，嚴(yán)媚，劉玉

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，新疆烏魯木齊830054）

目的探討維生素D受體（VDR）基因BsmⅠ位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病（AL）的相關(guān)性。方法以新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科150例急性白血病患者（維吾爾族83例，漢族67例）及161例（維吾爾族75例，漢族86例）同期健康體檢兒童為研究對(duì)象，用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）檢測(cè)VDR基因BsmⅠ多態(tài)性分布。結(jié)果①白血病患兒與對(duì)照組的BsmⅠ基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.326和5.983，P=0.009和0.014）；②對(duì)于維吾爾族兒童，病例組與對(duì)照組的BsmⅠ基因型（GG+GA/AA）、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.296和1.027，P=0.255和0.311）；而對(duì)于漢族兒童，病例組與對(duì)照組的BsmⅠ基因型（GG+GA/AA）、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.414和6.661，P=0.001和0.010）。③就白血病患兒而言，維吾爾族與漢族的BsmⅠ基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.797和2.518，P=0.180和0.113）；對(duì)照組中維吾爾族與漢族的BsmⅠ基因型、等位基因分布差比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.650和0.000，P=0.420和0.993）。結(jié)論白血病患兒與非白血病患兒VDR基因BsmⅠ的多態(tài)性分布區(qū)別不大，BsmⅠ的多態(tài)性分布與白血病有相關(guān)性。其中BsmⅠ基因分布與漢族兒童白血病有相關(guān)性，而與維吾爾族兒童白血病無關(guān)。無論在白血病患兒或正常兒童，BsmⅠ基因型分布都不存在民族差異。

維生素D受體基因；兒童；白血病；維吾爾族；漢族

急性白血病（acute leukemia，AL）是一組高度異質(zhì)性的造血干細(xì)胞惡性、克隆性疾病，是兒童時(shí)期最常見的惡性腫瘤，居兒童惡性腫瘤死亡率的首位，嚴(yán)重威害兒童的健康[1-2]。白血病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，分子生物學(xué)研究證明AL的本質(zhì)是多基因異常引起的惡性腫瘤，涉及許多癌基因的激活和/或抑癌基因的失活，是一個(gè)多步驟的過程[3-4]，近十幾年來，人們先后在多種白血病細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）的表達(dá)。VDR在多種白血病細(xì)胞的表達(dá)使學(xué)者們認(rèn)為白血病細(xì)胞是維生素D和VDR作用的靶細(xì)胞，VDR基因可能是白血病的易感基因[5]。VDR基因與急性白血病的相關(guān)性開始受到關(guān)注，但研究較少且結(jié)論不一致。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法，對(duì)新疆維吾爾族、漢族VDR基因BsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與急性白血病的相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2013年09月-2015年1月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)（morphology immunology cytogenetics molecular，MICM）分型確診的150例兒童為病例組，在知情同意的原則下選取同期在兒科預(yù)防保健門診體檢的161例非白血病兒童為對(duì)照組。排除合并其他惡性腫瘤及其他嚴(yán)重心、腦、腎疾病的患兒；年齡28 d～14歲，平均（3.56±0.58）歲，個(gè)體間無血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1 儀器與試劑全血提取DNA試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，PCR正、反向引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)，限制性內(nèi)切酶由美國MBI公司生產(chǎn)，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix及100 bp DNA Ladder Marker、10×TBE電泳緩沖液由大連寶生生物工程有限公司生產(chǎn)，瓊脂糖和溴化乙錠分別由法國Biowest agre公司和美國Sigma公司生產(chǎn)。

1.2.2 DNA提取晨起空腹采集新鮮靜脈血1～2ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，進(jìn)行DNA提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序①引物序列：通過美國國家生物信息中心（National Center of Biology Information，NCBI）的Gene Bank獲取VDR基因序列及BsmⅠ位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性信息，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。BsmⅠ正向引物：5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3'，BsmⅠ反向引物：5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAG GG-3'，②PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系包括DNA模板0.2μg，正、反向引物各0.2μl，Premix Taq 10μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)總體積至20μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。③PCR-RFLP分析：取PCR產(chǎn)物10μl，加入0.2μl相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶及緩沖液，恒溫37℃水浴箱中酶切90 min。酶切產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠上電泳30 min，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。④隨機(jī)抽取經(jīng)PCR-RFLP確定的不同基因型的PCR產(chǎn)物各兩例送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件讀出后與Gene Bank序列進(jìn)行對(duì)比。

1.2.4 質(zhì)量控制①所有調(diào)查人員經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)；②實(shí)驗(yàn)在盲法下進(jìn)行；③隨機(jī)抽取10％標(biāo)本行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測(cè)基因型與之前結(jié)果完全一致。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，Hardy-Weinberg遺傳平衡和不同組的基因型分布、等位基因頻率比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基因型的PCR-RFLP分析

BsmⅠ可分別得到3種基因型：①等位基因無酶切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)203bp 1條帶，表示為AA；②只有1個(gè)酶切位點(diǎn)的雜合子出現(xiàn)461、258和203 bp 3條帶，表示為GA；③有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的純合子出現(xiàn)258和203 bp兩條帶，表示為GG。見圖1。

圖1 VDR-PCR產(chǎn)物經(jīng)BsmⅠ酶切后的電泳圖

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

將對(duì)照組中漢族及維吾爾族兒童的BsmⅠ基因位點(diǎn)的實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明BsmⅠ基因位點(diǎn)分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=1.171和0.980，P=0.560和1.000）。見表1。

2.3病例組和對(duì)照組BsmⅠ基因型及等位基因的分布特點(diǎn)

白血病與非白血病患兒3種BsmⅠ基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.326，P=0.009）；等位基因分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.983，P=0.014）。見表2。

2.4不同民族病例組和對(duì)照組BsmⅠ基因型的分布特點(diǎn)

漢族病例組與對(duì)照組GG+GA/AA基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.414和6.661，P=0.001和0.010）；維吾爾族病例組與對(duì)照組GG+GA/AA基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.296和1.027，P=0.255和0.311）。見表3。

2.5病例組和對(duì)照組不同民族BsmⅠ基因位點(diǎn)多態(tài)性的分布特點(diǎn)

病例組中漢族與維吾爾族GG+GA/AA基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.797和2.518，P=0.180和0.113）；對(duì)照組中BsmⅠ基因分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.650和0.000，P=0.420和0.993）。見表4。

表1 對(duì)照組漢族及維吾爾族兒童維生素D受體BsmⅠ基因位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

表2 病例組和對(duì)照組BsmⅠ基因多態(tài)性及等位基因的分布比較例（％）

表3 不同民族病例組和對(duì)照組BsmⅠ基因多態(tài)性的分布比較

表4 病例組和對(duì)照組不同民族BsmⅠ基因位點(diǎn)的分布比較

3 討論

維生素D是脂溶性維生素，對(duì)人類健康特別是兒童健康具有重要意義。VDR能在全身多個(gè)系統(tǒng)器官組織中表達(dá)，并具有多種功能，如調(diào)節(jié)激素分泌、影響免疫功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞增生與分化等[6]。人體內(nèi)幾乎所有組織細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞均有VDR存在，這可能是維生素D及其類似物影響多種腫瘤細(xì)胞的原因之一[7]。最近較多國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，維生素D還能調(diào)節(jié)多種正常或腫瘤組織細(xì)胞的生長和分化，該作用是通過維生素D3受體介導(dǎo)[8-9]。目前研究表明，VDR與多種腫瘤有相關(guān)性。劉靜波等[10]研究顯示，VDR基因BsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，BsmⅠ位點(diǎn)B等位基因可能增加肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示，VDR基因多態(tài)性與乳腺癌存在一定的相關(guān)性[11]。國外研究顯示，中國漢族人群與歐洲人種BsmⅠ基因多態(tài)性位點(diǎn)分布比較。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。寧夏回族自治區(qū)的一項(xiàng)研究顯示，漢族與回族BsmⅠ基因多態(tài)分性分布比較。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此維生素D受體基因多態(tài)性可能存在民族差異。

本研究通過對(duì)漢維族的白血病患兒、非白血患兒的BsmⅠ不同基因型進(jìn)行檢測(cè)，以證實(shí)不同基因型VDR在維、漢患兒白血病發(fā)生中的重要作用。本研究結(jié)果表明，白血病及非白血病患兒BsmⅠ基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示白血病的發(fā)生與BsmⅠ有相關(guān)性，與鄭敏等[13]在廣西漢族白血病患兒維生素D受體基因多態(tài)性的研究結(jié)果不同。MANCHANDA等[14]研究結(jié)果表明，病例組與對(duì)照組BsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示VDR基因BsmⅠ酶切位點(diǎn)的多態(tài)性可能與兒童白血病的遺傳易感性無關(guān)。但國外研究顯示，病例組與對(duì)照組BsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]，與新疆地區(qū)的白血病基因分布相似。本研究加入民族因素，將漢族及維吾爾族的病例組及對(duì)照組分別進(jìn)行分析，漢族的白血病患兒與對(duì)照組的BsmⅠ基因型分布、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但維吾爾族兒童的分析結(jié)果與其相反，并且無論在病例組還是對(duì)照組中，漢族與維吾爾族的上述基因分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國外ZHANG等[12]研究結(jié)果不同。但上述研究并未涉及漢族與維吾爾族的比較，其初步結(jié)論提示維、漢患兒的BsmⅠ基因型分布無明顯區(qū)別。不同地區(qū)、不同人種的遺傳因素可能不同。環(huán)境因素的差異，以及環(huán)境及遺傳因素的相互作用使基因型分布更復(fù)雜。本研究僅限于在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的兒童，樣本量受限，有待進(jìn)一步研究。

[1]JACOBYE,CHIEN CD,FRY TJ.Murine models of acute leukemia∶important tools in current pediatric leukemia research[J].Front Oncol,2014,4(95)∶1-13.

[2]SISON EA,BROWN P.Does hematopoietic stem cell transplantation benefit infants with acute leukemia[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2013,2013∶601-604.

[3]LIANG KL,RISHI L,KEESHAN K.Tribbles in acute leukemia[J].Blood,2013,121(21)∶4265-4270.

[4]WINTER SS.Pediatric acute leukemia therapies informed by molecular analysis of high-risk disease[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2011,2011∶366-373.

[5]HE Q,ANANABA GA,PATRICKSON J,et al.Chlamydial infection in vitamin D receptor knockout mice is more intense and prolonged than in wild-type mice[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2013,135∶7-14.

[6]鄭敏,劉強(qiáng).維生素D及維生素D受體的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(21)∶3965-3967.

[7]ZHAO Y,LIAO S,HE J,et al.Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with metabolic syndrome∶a case-control design of population-based cross-sectional study in north China[J].Lipids Health Dis,2014,13∶129.

[8]AREESHI MY,MANDAL RK,AKHTER N,et al.Evaluating the association between taqi variant of vitamin D receptor gene and susceptibility to tuberculosis∶a meta-analysis[J].Toxicol Int,2014,21(2)∶140-147.

[9]GHORBANIHAGHJO A,ARGANI H,SAMADI N,et al.Relationship between vitamin D receptor gene foki and apai polymorphisms and serum levels of fetuin-A,vitamin D,and parathyroid hormone in patients on hemodialysis[J].Iran J Kidney Dis,2014,8(5)∶394-400.

[10]劉靜波,侯燕燕,齊曦明,等.維生素D受體基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥,2014(12)∶1780-1782.

[11]鮑劉莉,李哲光,彭景.維生素D代謝與乳腺癌預(yù)防[J].揚(yáng)州大學(xué)烹飪學(xué)報(bào),2012,29(2)∶50-53.

[12]ZHANG K,SONG L.Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and breast cancer risk∶a meta-analysis of 39 studies[J].PLoS One,2014,9(4)∶1-9.

[13]鄭敏,羅建明.維生素D受體基因BsmI位點(diǎn)多態(tài)性與兒童白血病易感性的關(guān)系研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(21)∶3896-3898.

[14]MANCHANDA PK,BID HK.Vitamin D receptor and type 2 diabetes mellitus∶growing therapeutic opportunities[J].Indian J Hum Genet,2012,18(3)∶274-275.

（童穎丹 編輯）

Association of vitamin D receptor geneBsmⅠpolymorphism in Han and Uighur children with acute leukemia*

Zhen-zhen WANG,Xue-mei WANG,Mei YAN,Yu LIU
(Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830054,P.R.China)

【Objective】To investigate the relationship between vitamin D receptor(VDR)geneBsmⅠpolymorphism and hereditary susceptibility of Han and Uighur children with acute leukemia.【Methods】The VDR geneBsmⅠwas detected in 150 children with acute leukemia(83 Uighur and 67 Han)and 161 healthy controls(75 Uighur and 86 Han)using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.【Results】①There were statistically significant differences in frequencies ofBsmⅠgenotype and the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls(χ2=9.326 and 5.983,P=0.009 and 0.014).②There was no significant difference in frequencies ofBsmⅠgenotype(GG+GA/AA)or the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls of Uighur children(χ2=1.296,1.027;P=0.255,0.311),while there were statistically significant differences in frequencies ofBsmⅠgenotype(GG+GA/AA)and the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls of Han children(χ2=10.414 and 6.661,P=0.001 and 0.010).③There was no significant difference in frequencies ofBsmⅠgenotype or the alleles of either acute leukemia cases(χ2=7.797,2.518;P=0.180,0.113)or healthy controls(χ2=0.650,and 0.000;P=0.420 and 0.993)between the Han and Uighur children.【Conclusions】Polymorphism distribution of VDR geneBsmⅠis associated with acute leukemia of Han children,but not associated with acute leukemia of Uighur children.BsmⅠis not associated with ethic difference.

vitamin D receptor gene;child;acute leukemia;Uighur;Han

R733.7

A

1005-8982（2015）35-0058-04

2015-10-20

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研項(xiàng)目（No：2012QN04）

嚴(yán)媚，E-mail：yan10mei25@163.com；Tel：13669901666