細胞團塊收集器聯合免疫標記在良、惡性胸水中的應用研究*

韓軍平，王麗曾，羅文瀟，馬文霞，達春和

（甘肅省白銀市第一人民醫院1.病理科，2.呼吸科，甘肅白銀730900）

·臨床論著·

細胞團塊收集器聯合免疫標記在良、惡性胸水中的應用研究*

韓軍平1，王麗曾1，羅文瀟1，馬文霞1，達春和2

（甘肅省白銀市第一人民醫院1.病理科，2.呼吸科，甘肅白銀730900）

目的探討細胞團塊收集器聯合免疫標記在良、惡性胸水中的應用。方法采用細胞團塊收集器收集胸水，將臨床送檢的115例胸水制作細胞切片，蘇木精-伊紅染色法（HE）、免疫組織化學法染色，行細胞形態學觀察及鑒別診斷，并與2009～2013年送檢的胸水標本經傳統細胞涂片或液基薄層技術細胞診斷結果進行比較研究。結果115例胸水中，經免疫及形態學證實為惡性胸水18例，惡性細胞檢出率為16％，傳統細胞涂片胸水癌細胞檢測陽性率為5％，差異有統計學意義（P＜0.05）。在異型性細胞中，Ki-67、癌胚抗原（CEA）、甲狀腺轉錄因子-1（TTF-1）、Napsin-A、細胞角蛋白7（CK7）在肺腺癌細胞中表達較好；而Calretinin、間皮細胞（MC）、Wilms腫瘤基因（WT1）在間皮細胞中表達較好，其表達率在良、惡性胸水中比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論利用細胞團塊聯合免疫標記能極大地提高良、惡性胸水診斷的準確率，并能客觀地對惡性腫瘤細胞進行分型，提高癌細胞檢出率、準確率，有利于腫瘤分型。

細胞團塊收集器；良、惡性胸水；肺腺癌；免疫標記

胸、腹水脫落細胞檢查，可用于判斷胸、腹水的良、惡性及惡性腫瘤類型和來源，為臨床診治、判斷預后提供科學依據。傳統的細胞涂片或液基薄層細胞涂片技術因為細胞數量有限，細胞重疊堆積、薄厚不均、結構不清，所以惡性腫瘤細胞檢出率、準確率較低。本研究利用細胞團塊收集器收集體液標本中細胞的方法，收集胸水中脫落細胞，并檢測間皮細胞（mesothelial cell，MC）、甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcriptionfactor-1，TTF-1）、Calretinin、Napsin-A、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、Ki-67、細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）等，結合蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）病理形態鑒別良、惡性胸水，并進行腫瘤分型，為治療提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1材料與試劑

選取甘肅省白銀市第一人民醫院2014年1月-2014年9月臨床送檢胸水標本115例，所有標本利用細胞團塊收集器制作細胞團塊。同時收集2009年1月-2013年1月病理科胸水脫落細胞診斷結果。細胞團塊收集器、蛋白螯合劑為本實驗室研發；免疫組織化學法染色過程所需單克隆抗體：Ki-67、Calretinin、MC、CEA、Wilms腫瘤基因（Wilms'tumor gene，WT1）、TTF-1、Napsin-A、CK7及鼠抗人單克隆抗體CK5/6，試劑盒UltraSensitive SP購自福州邁新生物技術開發有限公司，按試劑盒說明書進行操作，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作陰性對照組。

1.2實驗方法

臨床抽取的胸、腹水標本除做其他檢查外，其余全部立即送檢，一般為200～800 ml。將胸水標本測量體積，按照1∶10的比例加入4％甲醛溶液，標本以10％福爾馬林固定。自然沉降30～60 min，棄上清液，留沉淀物30～50 ml，置入50 ml離心管中，2 000 r/min離心10 min。棄上清液，取沉淀物1～2滴進行常規涂片，并在剩余沉淀物中加入1 ml 95％乙醇，混勻沉淀物，加入1滴蛋白螯合劑，混勻；將混合液全部置入細胞團塊收集器中，2 000 r/min離心10 min，取出細胞團塊，包埋、常規脫水、透明、浸蠟后包埋，制成4μm厚的細胞塊石蠟切片，HE染色，免疫組織化學法檢測，細胞切片和細胞涂片對比觀察，鑒別胸水的良、惡性，同時診斷腫瘤類型。

1.3結果判斷

細胞學診斷標準參照《細胞病理學診斷圖譜及實驗技術》[1]。所有涂片、切片經2位有經驗的病理科副主任醫師閱片，胸水癌細胞陽性患者，需經病理活檢資料證實或臨床綜合資料的驗證；免疫組織化學法染色中Calretinin、MC、CEA、Napsin-A、CK7、CK5/6蛋白在細胞膜中表達，Ki-67、WT1、TTF-1蛋白在細胞核中表達，為棕黃色顆粒；陽性細胞率＞10％為陽性[2]。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料以率表示，兩兩間用χ2檢驗并行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.12009～2014年同期胸水標本癌細胞檢出率

本實驗室對2009～2014年1～9月份同期胸、腹水標本癌細胞檢出率進行分析，統計結果顯示，2009～2013年1～9月份使用傳統細胞涂片或液基薄層細胞涂片技術，胸、腹水癌細胞檢測陽性率為5％；2014年同期使用團塊收集器，胸、腹水癌細胞檢測陽性率為16％，是以往普通涂片胸、腹水癌細胞檢測陽性率的3倍多，差異有統計學意義（χ2=7.856，P=0.023）（見表1）。分析其原因：①關鍵是不能對送檢胸、腹水所有細胞進行檢測；②細胞涂片免疫組織化學法效果沒有細胞切片免疫組織化學法效果好（見圖1～4）。

2.2免疫組織化學表達特點

表1 2009～2014年同期胸、腹水標本癌細胞檢出率

31例核異型性胸水中，病理細胞學檢查發現17例肺腺癌，1例為神經內分泌癌，并得到組織學證實。在17例肺腺癌中，CEA、TTF-1、Napsin-A及CK7全部表達，Calretinin、MC不表達，WT1＜20％，Ki-67增殖指數為（25.47±24.0）。Ki-67、Calretinin、MC、CEA、TTF-1、Napsin-A及CK7在間皮細胞增生及肺腺癌間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），WT1、CK5/6在間皮細胞增生及肺腺癌間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 細胞涂片見巢團狀、單個排列的瘤細胞，細胞結構模糊（HE×200）

圖2 細胞切片中見腺樣排列的瘤細胞（HE×200）

圖3 組織切片見癌組織成乳頭狀、腺管狀、條索狀排列，浸潤至纖維間質（HE×200）

圖4 免疫組織化學結果，癌細胞CK7+（×200）

表2 31例核異型性胸水患者的免疫組織化學表達特點

3 討論

胸、腹水脫落細胞檢查是判斷良、惡性及惡性腫瘤類型和來源的主要手段，為臨床診治、判斷預后提供科學依據。引起胸、腹水常見的原因有肺癌、乳腺癌、卵巢癌、消化道腫瘤、淋巴瘤及間皮瘤等，準確判斷胸、腹水中細胞是間皮細胞還是腫瘤細胞，或其他類型腫瘤細胞，為臨床治療和預后提供重要依據。傳統的細胞涂片或液基薄層細胞涂片技術由于細胞數量多，涂片厚，免疫組織化學法難以進行質量控制，在鑒別診斷中存在困難[3]。

本實驗室研發一種細胞團塊收集器及收集方法，極大地提高惡性腫瘤細胞檢出率及準確率。利用細胞團塊收集器制作法，收集脫落細胞制作石蠟包埋切片具有以下優點：①可以把患者送檢的胸、腹水、尿液等體液標本固定細胞后全部包埋切片，可連續切片，減少漏診，提高脫落細胞的陽性檢出率。②克服傳統涂片中細胞重疊堆積、薄厚不均、結構不清的現象，確保對細胞學的正確診斷。③可長期保存，反復重切，并能做多種特殊染色或免疫組織化學法檢測，對惡性腫瘤的分類有很大幫助，減少誤診，為臨床治療提供依據和方便。該方法具有很大的推廣和應用前景[4]。

研究發現，Napsin-A對原發性肺腺癌、鱗狀細胞癌及其他轉移性惡性腫瘤的診斷具有較高的敏感性和特異性[5-7]。本實驗顯示，原發性肺腺癌中Napsin-A呈強陽性，表達率為100％，具有較高的特異性；其在轉移性腺癌、鱗癌及肺良性胸腔積液中未見陽性表達，與相關報道一致[8]。國內外關于TTF-1在肺癌中的研究報道較多，且研究結果顯示，TTF-1主要在肺腺癌和小細胞癌中表達，肺腺癌中TTF-1的陽性表達率為27％～100％[9]。同時TTF-1在原發性肺腺癌中的表達具有較高的敏感性和特異性，可作為一種有價值的標記物，用于原發和轉移性肺腺癌的鑒別；本研究顯示，TTF-1表達率為100％，具有較高的特異性，與相關報道一致[10]。CK7是許多腺上皮及移行上皮中的一種堿性角蛋白（如肺、乳腺、卵巢等），CEA是一種胎兒腸道產生的癌胚抗原，在肺腺癌中高表達。Calretinin是一種細胞內鈣結合蛋白，和MC主要在正常和腫瘤性間皮細胞中表達。Ki-67是判斷細胞增殖活性的指標，其高、低與許多腫瘤的分化程度、浸潤轉移及預后密切相關。

綜上所述，通過細胞團塊收集器及收集方法聯合檢測Ki-67、Calretinin、MC、CEA、WT1、TTF-1、Napsin-A、CK7及CK5/6免疫標記物，可鑒別良、惡性胸水，是判斷反應性間皮細胞和腫瘤細胞組織學來源的較好指標。

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（童穎丹 編輯）

Application of cell mass collector combined with immune markers in diagnosis of benign and malignant pleural effusion*

Jun-ping HAN1,Li-zeng WANG1,Wen-xiao LUO1,Wen-xia MA1,Chun-he DA2
(1.Department of Pathology,2.Department of Respiratory Diseases,the First People's Hospital of Baiyin,Baiyin,Gansu 730900,P.R.China)

【Objective】】To apply cell mass collector combined with immune markers in the diagnosis of benign and malignant pleural effusion.【Methods】Pleural effusion of 115 cases was collected with the cell clump collector.Effusion smears were checked through H.E.staining and immunohistochemical staining.Cell morphology was observed and differential diagnosis was made.Then the results were compared with the diagnostic results of traditional cell smear and thin liquid layer technology for pleural effusion from 2009 to 2013.【Results】In 115 cases with pleural effusion,18 cases were confirmed to have malignant pleural effusion by immunohistochemistry and morphology.The positive rate of malignant cells was 16％while it was 5％using traditional cell smear of pleural effusion,and there was a significant difference between them(P＜0.05).CEA,Napsin-A,TTF-1,CK7 and Ki-67 were expressed in the lung adenocarcinoma cells,while MC,WT1 and calretinin were expressed in mesothelial cells,and there were significant differences in the positive rates between benign and malignant pleural effusion(P＜0.05).【Conclusions】Application of cell mass collector combined with immune markers can improve the diagnosis of benign and malignant pleural effusion,increase the detection rate and accuracy and facilitate classification of malignant tumor cells.

cell mass collector;benign and malignant pleural effusion;lung adenocarcinoma;immune marker

R365

A

1005-8982（2015）35-0062-04

2015-05-26

甘肅省衛生行業科研計劃項目（No：GSWSKY-2015-69）