黃芪甲苷對高胰島素誘導人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及機制研究

李貴平，李維祖，段文婷，李衛平，2

黃芪甲苷對高胰島素誘導人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及機制研究

李貴平1，李維祖1，段文婷1，李衛平1，2

摘要目的研究黃芪甲苷（As-IV）對高胰島素誘導人腎小球系膜細胞（HMCs）損傷的保護作用及其機制。方法以HMCs為研究對象，用MTT法檢測不同濃度胰島素作用不同時間后對HMCs增殖的影響，篩選胰島素的量效與時效關系；實驗設正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、二碘苯（DPI 10 μmol／L）組、抗氧化劑Tempol（100μmol／L）組、PI3K／Akt信號通路抑制劑LY294002（10μmol／L）組與黃芪甲苷（As-Ⅳ25、50、100μmol／L）組。培養48 h后，MTT法檢測HMCs的細胞增殖狀況，DCFH-DA法測定細胞內活性氧（ROS）含量，Western blot法檢測NADPH氧化酶4（NOX4）、磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）（又稱p-Akt）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）蛋白表達的變化。結果隨著濃度增加與作用時間延長，胰島素對HMCs增殖有促進作用且有量效與時效關系；與高胰島素組比較，DPI組、Tempol組、LY294002組與As-IV 25、50、100μmol／L組均能有效抑制高胰島素誘導的細胞增殖，減少細胞內ROS含量，降低NOX4、p-Akt、pmTOR蛋白的高表達（P＜0．05，P＜0．01）。結論胰島素呈時間和濃度依賴性促HMCs細胞增殖；As-IV對高胰島素誘導的HMCs有保護作用，其作用機制可能與抑制HMCs的過度增殖，減少細胞內ROS生成，降低NOX4、p-Akt、p-mTOR蛋白高表達有關。

關鍵詞高胰島素；人腎小球系膜細胞；黃芪甲苷；活性氧；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化哺乳動物雷帕雷素靶蛋白

2015-06-25接收

2安慶醫藥高等專科學校，安慶246052

李衛平，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lwp19＠126．com

高胰島素血癥（hyperinsulinism，HINS）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）的常見臨床表現之一，既是1型糖尿病治療中的常見現象，也是2型糖尿病的重要特征。糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）作為DM的常見并發癥，其發病機制十分復雜。HINS能夠促進DN的發生發展，加重腎損傷［1-3］。黃芪甲苷（astragalosides IV，As-IV）是從豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根中分離的一種單體化合物，是黃芪發揮藥理作用的重要有效成分。研究［4-5］顯示，黃芪甲苷有抑制細胞肥大、抗氧化、免疫調節等多種藥理作用。該研究采用體外培養人腎小球系膜細胞（human mesangial cells，HMCs），根據文獻［6-7］，設計觀察1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L胰島素對HMCs細胞增殖的影響，并模擬HINSDM患者體內的高胰島素環境，觀察高胰島素對HMCs以及As-IV對高胰島素處理的HMCs中NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）、磷酸化蛋白激酶B（phosphor-protein kinase b，p-PKB）（又稱p-Akt）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphor-mammalian targetof rapamycin，p-mTOR）蛋白表達、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的影響，探討HINS誘導DN發生發展及As-IV發揮保護作用的可能機制，從而為臨床上 DN的防治及 As-IV的應用提供依據。

1　材料與方法

1．1材料HMCs株（中南大學現代分析測試中心細胞室）；As-IV純度＞98%（南京澤朗醫藥科技有限公司）；牛胰島素、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二碘苯（DPI）、抗氧化劑Tempol、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；PI3K／Akt信號通路抑制劑LY294002（Abmole中國公司）；DMEM低糖培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青科技有限公司）；二氫二氯熒光素（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；β-actin（北京中杉金橋生物技術有限公司）；NOX4（美國Santa Cruz公司）；p-Akt、p-mTOR（美國Bioworld公司）。

1．2方法

1．2．1細胞培養與分組將常規方法復蘇的HMCs培養于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基中。選取NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI、強效抗氧化劑Tempol、PI3K／Akt信號通路特異性抑制劑LY294002作為陽性藥。將實驗細胞分組如下：①正常組、胰島素組（分別含1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L胰島素）；②正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、DPI（10μmol／L）組、Tempol（100μmol／L）組、LY294002（10μmol／L）組與As-IV（25、50、100 μmol／L）組；③正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、DPI（10μmol／L）組、LY294002（10μmol／L）組與As-IV（25、50、100μmol／L）組；④正常組、高胰島素（64 nmol／L）組、Tempol（100μmol／L）組、LY294002（10 μmol／L）組與As-IV（25、50、100μmol／L）組。

1．2．2MTT比色法檢測細胞增殖取對數生長期細胞，0．25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養基稀釋成單個細胞懸浮液。以2×104／孔密度接種于96孔板。24 h后細胞貼壁、展開完全，小心吸棄培養液，各孔均加入200μl無血清培養基饑餓24 h使其同步化。輕輕棄掉上清液，按1．2．1①、1．2．1②分組，每組各設6個復孔，給藥。1．2．1①繼續培養12、24、48 h后，1．2．1②繼續培養48 h后每孔加入20μlMTT（5 mg／ml），避光，恒溫培養箱繼續培養。4 h后小心棄掉上清液，每孔加入150μl DMSO，持續振蕩使藍紫色結晶完全溶解，10 min后于酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度（optical density，OD）值。

1．2．3DCFH-DA法測定細胞內ROS含量將單個HMCs懸浮液以3×105／孔密度接種于24孔細胞培養板。24 h后細胞貼壁、展開完全，小心吸棄培養液，各孔加入500μl無血清培養基饑餓24 h使其同步化。輕輕棄液，按1．2．1②分組，每組設3個復孔，給藥。繼續培養48 h后，每孔加入不含血清、含10μmol／L DCFH-DA的培養基500μl，37℃培養箱繼續孵育20 min，每隔3 min或5 min搖晃混勻一次，使探針與細胞充分接觸。用無血清培養基洗滌各孔3次，以充分清除未進入細胞內的DCFH-DA探針。熒光顯微鏡下隨機選取3個不同區域拍照，采用IPP軟件分析3個視野內綠色熒光強度的平均值，再對各組進行統計學分析。

1．2．4Western blot法檢測細胞內NOX4、p-Akt、pmTOR蛋白的表達將單個HMCs懸浮液以4× 107／瓶密度接種于25 mm2細胞培養瓶中。24 h后細胞貼壁、展開完全，棄掉培養液，加入5 m l無血清培養基饑餓24 h使其同步化。棄液，分組同1．2．1③、1．2．1④。繼續培養48 h后，棄液，用4℃預冷的PBS 5 m l洗2次，吸干瓶內液體后置于冰上。每瓶加入120μl裂解液，4℃搖床上充分裂解20～30 min后，用細胞刮刮下細胞并收集至1．5 m l EP管中。于4℃以12 000 r／min離心15 min。離心完畢后，收集上清液至500μl EP管中。BCA蛋白定量法測定各組蛋白含量。剩余蛋白以4∶1比例與5×上樣緩沖液充分混合均勻后，置于100℃金屬浴10 min以充分變性。于SDS-PAGE凝膠上電泳分離，其后電轉移至 PVDF膜上，PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST于水平搖床上室溫封閉2 h。TBST洗后加入一抗 NOX4（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）、pmTOR（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）置于4℃搖床上孵育過夜。TBST洗后加入辣根過氧化物標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。TBST洗后用ECL化學發光法顯影。最后用Image J軟件分析灰度值。

1．3統計學處理采用SPSS 19．0統計軟件進行分析，實驗結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結果

2.1胰島素對HMCs細胞增殖的影響采用單因素方差分析進行主體間效應的檢驗（F值分別為12 h：3．59，24 h：3．78，48 h：7．72，P＜0．01）。LSD兩兩比較結果顯示，與正常組比較，體外培養12、24、48 h后的胰島素1、2、4、8、16、32、64、128 nmol／L組的OD值均有不同程度的上升，其中，12 h時，胰島素64、128 nmol／L組；24 h時，胰島素32、64、128 nmol／L組；48 h時，胰島素32、64、128 nmol／L組與正常組比較差異均有統計學意義（P＜0．05，P＜0．01），表明胰島素對HMCs細胞增殖有促進作用，并呈時間和濃度依賴性。見表1。

2.2As-IV對高胰島素誘導的HMCs增殖的影響采用單因素方差分析進行主體間效應的檢驗（F＝12．48，P＜0．01）。LSD兩兩比較結果顯示，與正常組比較，高胰島素組在培養48 h后，OD值顯著上升（P ＜0．01）。與高胰島素組比較，各用藥組OD值均下降，As-IV組隨藥物濃度的增加OD值依次降低（P＜0．05，P＜0．01），表明As-IV對高胰島素誘導的HMCs增殖具有抑制作用，呈濃度依賴性。見表2。

2.3As-IV對高胰島素誘導的HM Cs中ROS含量的影響采用單因素方差分析進行主體間效應的檢驗（F＝63．49，P＜0．01）。LSD兩兩比較結果顯示，與正常組比較，高胰島素組細胞內熒光強度明顯增強，表明高胰島素加重了細胞的氧化應激反應，使ROS含量升高（P＜0．01）。與高胰島素組比較，各用藥組細胞內熒光強度均出現不同程度減弱，表明ROS含量降低，氧化應激反應減弱，且As-IV降低細胞內ROS含量呈濃度依賴性（P＜0．05，P＜0．01）。見圖1。

表1　不同濃度胰島素對體外培養12、24、48 h 的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

表1　不同濃度胰島素對體外培養12、24、48 h 的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

與12h正常組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01；與24 h正常組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與48 h正常組比較：△P＜0．05，△△P＜0．01

OD值組別12 h　24 h　48 h正常0．235±0．015　0．333±0．008　0．532±0．013胰島素（nmol／L）1 0．236±0．013　0．334±0．019　0．535±0．036 2 0．238±0．013　0．338±0．034　0．541±0．028 4 0．241±0．016　0．341±0．027　0．548±0．022 8 0．247±0．022　0．350±0．027　0．559±0．036 16　0．254±0．025　0．362±0．033　0．595±0．058 32　0．258±0．038　0．370±0．035*　0．615±0．068△64　0．261±0．024＃　0．384±0．050*　0．636±0．077△△128　0．271±0．026＃＃　0．404±0．040**0．685±0．042△△

表2　As-IV對高胰島素誘導的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

表2　As-IV對高胰島素誘導的HMCs增殖的影響（n＝6，±s）

與正常組比較：＃＃P＜0．01；與高胰島素組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　48 h OD值正常0．451±0．027高胰島素（64 nmol／L）　0．579±0．013＃＃DPI（10μmol／L）　0．474±0．022**Tempol（100μmol／L）　0．452±0．032**LY294002（10μmol／L）　0．468±0．024**As-IV（μmol／L）25　0．520±0．042*50　0．494±0．030**100　0．456±0．038**

2.4As-IV對高胰島素誘導的HMCs中NOX4、p-Ak t、p-m TOR蛋白表達的影響采用單因素方差分析進行主體間效應的檢驗（F值分別為 NOX4：12．02，p-Akt：13．85，p-mTOR：47．45，P＜0．01）。LSD兩兩比較結果顯示，與正常組比較，高胰島素組HMCs中NOX4、p-Akt、p-mTOR蛋白表達均顯著增加（P＜0．01）。與高胰島素組比較，DPI組、LY294002組、As-IV 25、50、100μmol／L組HMCs中NOX4蛋白表達下調；Tempol組、LY294002組、As-IV 25、50、100μmol／L組HMCs中p-Akt、p-mTOR蛋白表達也呈現不同程度的下調（P＜0．05，P＜0．01）。見圖2。

3　討論

2013年調查結果顯示，根據國際最新臨床診斷標準，我國成年人DM患病率為11．6%，約1．139億人，其中，2型DM約占90%～95%。我國2型DM并發腎病的概率為34．7%。2型DM普遍存在胰島素抵抗早有定論，在此基礎上引發的HINS也相當常見，而HINS在聯系DM與其他疾病中發揮著重要作用。微量白蛋白尿是早期DN的一個重要標志，其與腎臟疾病進程密切相關［8］。HINS與微量白蛋白尿或尿白蛋白排泄率存在明顯聯系已被大量流行病學研究［1］證實。對第三世界健康與營養調查發現，慢性腎臟疾病的患病率與HINS呈獨立相關［2］。動物實驗［3］表明，在 HINS階段即可出現 DN的早期特征性病變即腎小球肥大。該實驗模擬HINSDM患者體內的高胰島素環境，選取腎臟固有細胞HMCs進行體外培養實驗。結果顯示，不同濃度胰島素作用不同時間后，HMCs均有不同程度的增殖，呈現出一定的時間和濃度依賴性；其中64 nmol／L胰島素作用48 h后，HMCs增殖顯著、穩定，同時NOX4蛋白表達上調，ROS含量增加，表明高胰島素不僅能促進HMCs的過度增殖，還可加重其氧化應激反應。DPI作為特異性的NADPH氧化酶抑制劑，作用于HMCs后，NOX4蛋白表達顯著下降，ROS含量也明顯減少，表明HMCs中ROS的產生主要來源于NADPH氧化酶。細胞氧化應激增強，不僅會對腎臟組織直接造成損傷，還可增加多種與腎臟疾病相關的信號通路的激活及細胞因子的合成分泌［9］。

PI3K／Akt／mTOR作為胰島素的主要信號通路，也是體內重要的生存通路，在細胞的增殖、轉錄、肥大、能量代謝、凋亡等多種細胞功能中有重要作用。Akt參與構成細胞內多條信號通路，mTOR作為Akt的下游效應物，在DN發生發展中起重要調節作用，不僅與2型DM發病與進展有關，還與細胞外基質的積累、腎臟肥大以及腎小球基底膜增厚等相關［10］。實驗結果顯示，高胰島素作用48 h后，p-Akt、p-mTOR蛋白表達增加，提示高胰島素可通過激活PI3K／Akt／mTOR信號通路加重腎損傷。

黃芪作為常用中藥，已被證實具有多種藥理作用，該實驗主要探討As-IV防治DN作用及機制。結果顯示，各陽性藥及As-IV組均能有效抑制高胰島素誘導的HMCs細胞增殖，推測這可能是As-IV發揮保護作用的細胞學基礎。同時各用藥組亦能有效降低ROS含量，提高細胞抗氧化應激能力。此外各用藥組還能下調p-Akt、p-mTOR蛋白表達，抑制PI3K／Akt／mTOR信號通路的過度激活，減輕腎損傷。抗氧化劑Tempol在強效清除ROS的同時也可抑制Akt蛋白的過度磷酸化；PI3K／Akt信號通路抑制劑LY294002在抑制該信號通路激活的同時也可減少ROS含量，表明ROS可參與Akt蛋白的磷酸化，而磷酸化的Akt也可增加ROS含量，ROS與Akt蛋白的磷酸化存在正相關。推測ROS與PI3K／Akt信號通路在DN的發生發展中存在協同作用，提示As-IV可以通過作用于以上兩個靶點，發揮其對HMCs的保護作用。

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Protective effects of As-IV on high insulin induced human mesangial cells injury and itsmechanism s

Li Guiping，LiWeizu，Duan Wenting，et al
（Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the protective effects of astragalosides IV（As-IV）on high insulin induced human mesangial cells（HMCs）injury in vitro and itsmechanisms．MethodsWe used HMCs as research object，treated HMCswith different concentrationsand time of insulin，analyzed the proliferation by MTT assay to select the dose-and time-dependentmanners of insulin．The HMCs was divided and treated as follows：normal group（NG），high insulin group（HINS，64 nmol／L），DPI（10μmol／L），Tempol（100μmol／L），LY294002（10μmol／L）and As-IV（25，50，100μmol／L）．After treatment for 48 hours，the proliferation of HMCswas analyzed by MTT assay．The reactive oxygen species（ROS）production wasmeasured by 2，7-dichlorodihydto fluorescin diacetate （DCFH-DA）．The expressions of NADPH oxidase 4（NOX4），phosphor-protein kinase b（p-PKB）also named p-Akt and phosphor-mammalian target of rapamycin（p-mTOR）were analyzed byWestern blot．ResultsThe proliferation of HMCswas enhanced in a dose-and time-dependentmanner by increasing concentrations and time of insulin．Compared with HINS group，DPI，Tempol，LY294002，As-IV treatment significantly inhibited HMCs proliferation，reduced intracellular ROS contents and decreased expression of NOX4，p-Akt and p-mTOR（P＜0．05，P＜0．01）．ConclusionInsulin promotes proliferation of HMCs in a time-and dose-dependent manner．As-IV has protective effects on high insulin induced HMCs injury due to inhibition of HMCs proliferation，oxidative damage，NOX4，p-Akt and p-mTOR expression．

Key wordshigh insulin；humanmesangial cells；astragalosides IV；ROS；p-Akt；p-mTOR

中圖分類號R 587．1；R 285．5

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1629-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：81173624）；安徽省國際合作項目（編號：1230603007）；安徽省教育廳自然科學基金（編號：KJ2012A192）

作者單位：1安徽醫科大學藥理學教研室，合肥230032

作者簡介：李貴平，女，碩士研究生；