IGF1對高糖下內(nèi)皮細胞增殖及移行的影響

騰佳麗，劉彥君

IGF1對高糖下內(nèi)皮細胞增殖及移行的影響

騰佳麗，劉彥君

摘要目的觀察高糖下胰島素樣生長因子1（IGF1）對高糖下人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）增殖和移行的影響，并探討其可能影響機制。方法體外培養(yǎng)HUVEC，分為對照組、高糖組、高滲組、高糖＋IGF1組和高糖＋IGF1＋AZD5363組，四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測內(nèi)皮細胞增殖，Transwell小室觀察細胞移行。實時熒光定量PCR測定絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt）及叉頭轉錄因子1（FoxO1）的mRNA水平。免疫組化法測定內(nèi)皮細胞Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1的蛋白表達，并行半定量分析。結果與對照組比較，高糖組細胞存活率、移行率明顯降低，F(xiàn)oxO1 mRNA表達明顯升高，F(xiàn)oxO1／p-FoxO1蛋白表達增加，Akt／p-Akt比值增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋IGF1組細胞存活率、移行率明顯增加，F(xiàn)oxO1 mRNA的表達明顯降低，F(xiàn)oxO1／p-FoxO1蛋白表達降低，Akt／p-Akt蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；高糖＋IGF1＋AZD5363組細胞存活率未見明顯差異，移行未增加，F(xiàn)oxO1 mRNA的表達明顯降低（P＜0．05），F(xiàn)oxO1／p-FoxO1未見明顯差異。5組AktmRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義。結論IGF1能改善高糖對內(nèi)皮細胞增殖移行的抑制作用，其機制可能是IGF1激活Akt進一步調節(jié)FoxO1的表達。

關鍵詞IGF1；FoxO1；高糖；內(nèi)皮細胞；細胞增殖；移行

研究［1］顯示糖尿病患者心腦血管病變及周圍血管閉塞的風險遠高于非糖尿病患者。研究［2］顯示高血糖與糖尿病血管病變有關，內(nèi)皮細胞功能失調可能繼發(fā)于高血糖。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是細胞生長、分化和凋亡的重要調節(jié)因子。研究［3］證明IGF1具有多種代謝和血管保護作用，從很多方面直接對抗內(nèi)皮功能失調，目前關于IGF1的報道［4］多關注其在神經(jīng)損傷方面的研究，在血管保護方面的報道較少，且機制不清。IGF1可激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）／絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶（serine／threonine kinase，Akt）通路，調控叉頭轉錄因子-1（forkhead transcription factor 1，F(xiàn)oxO1）表達［3］。高糖可能通過PI3K／Akt的解偶聯(lián)參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展［5］。該研究擬探討IGF1對高糖下內(nèi)皮細胞增殖及移行的保護作用及其可能機制。

1　材料與方法

1．1主要材料與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）獲贈于中科院生物物理研究所（購自ATCC細胞庫），由解放軍306醫(yī)院實驗室保存，第2～5代的細胞用于本研究。內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液（endothelial cell growth medium，EGM）（瑞士lonza公司）；含有EDTA的胰酶（美國Gibco公司）；D-葡萄糖粉、缺乏生長因子的IV型膠原纖維（美國Sigma公司）；RNAiso及Q-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；抗-Akt單克隆抗體、抗磷酸化特異性Thr308Akt單克隆抗體、抗-FoxO1單克隆抗體、抗磷酸化特異性Ser256 FoxO1單克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的抗鼠抗體、免疫組化DAB發(fā)光試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Akt抑制劑（AZD5363，美國Selleck公司）；6、24、96孔板、24孔板Transwell小室（美國Corning公司）；PCR引物由上海生物工程技術有限公司合成；AIRTECH超凈工作臺（天津鈞星瑞科技有限公司）；7500 Real Time PCR System（美國Applied biosystems公司）；一體式微型化學發(fā)光成像儀（SmartChemi，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；電子顯微鏡（ICC50 HD，德國LEICA公司）。

1．2方法

1．2．1HUVEC的培養(yǎng)

用EGM培養(yǎng)基（含2%進口胎牛血清），在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，瓶底被細胞鋪滿80%時，用0．25%胰酶消化、傳代，取2～5代增殖旺盛的細胞用于實驗。隨機分為5組進行干預：對照組（5 mmol／L葡萄糖）；高糖組（25 mmol／L葡萄糖）；高糖＋IGF1組（25 mmol／L葡萄糖＋80 ng／m l IGF1）；高糖＋IGF1＋AZD5363組（25

2015－04－29接收

1．2．2HUVEC增殖實驗

將1×105個細胞／孔接種于0．1%IV型膠原纖維處理后的96孔板。無血清培養(yǎng)24 h后更換EGM培養(yǎng)液，按照不同方式分5組進行干預，終體積為200μl／孔。培養(yǎng)48 h后，棄上清液，每孔依次加入EGM培養(yǎng)液和四甲基偶氮唑藍（MTT）溶液20μl（5 mg／ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 150μl，置搖床室溫均勻震蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀檢測波長490 nm處吸光度（absorbance，A）值。按照下列公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）＝實驗組A值／對照組A值×100%。

1．2．3Transwell小室檢測HUVEC遷移

將細胞按照5×105個細胞／孔接種于0．1%IV型膠原纖維處理后的24孔板，上室EGM培養(yǎng)液每孔500μl，下室為對照組、高糖組、高糖＋IGF1組、高糖＋IGF1＋AZD5363組和高滲組培養(yǎng)液各1．5 ml，培養(yǎng)12 h后取出上室，刮除膜上層內(nèi)皮細胞，10%甲醛溶液固定后結晶紫染色，于光學顯微鏡下隨機6個視野計數(shù)，取均值。計算遷移抑制率，遷移抑制率（%）＝（對照組遷移細胞數(shù)－實驗組遷移細胞數(shù)）／對照組遷移細胞數(shù)×100%。

1．2．4采用SYBR GreenⅠ染料法實時熒光定量PCR檢測Akt、FoxO1 mRNA表達

將5×105個細胞／m l接種于6孔培養(yǎng)板，按照對照組、高糖組、高糖＋IGF1組、高糖＋IGF1＋AZD5363組和高滲組培養(yǎng)48 h后，Trizol法提取5組細胞總RNA，RT-PCR擴增目的基因。PCR引物序列為FoxO1上游引物：5′-GGCTGAGGGTTAGTGAGCAG-3′；FoxO1下游引物：5′-AAGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3′；Akt上游引物：5′-CTCATTCCAGACCCACGAC-3′；Akt下游引物：5′-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3′；β-actin上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；β-actin下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。反應參數(shù)：95℃預熱變性30 s；兩步法PCR：95℃變性15 s；60℃退火34 s；擴增40個循環(huán)；60℃延伸1 min。應用7500 System Software分析軟件，檢測目的基因與內(nèi)參擴增的Ct值，根據(jù)ΔΔCt＝ΔCt實驗組－ΔCt對照組，計算ΔΔCt值，得到實驗組目的基因相對于對照組目的基因的表達量（relative quantity，RQ），RQ＝2－ΔΔCt，然后進行統(tǒng)計分析。

1．2．5免疫組化法檢測細胞Akt／p-Akt、FoxO1／p-FoxO1蛋白表達

制備細胞爬片，培養(yǎng)細胞48 h后，進行免疫組化檢測。在高倍鏡下隨機觀察3個視野，計數(shù)細胞并對每個細胞進行評分。細胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分。將評分之和除以細胞數(shù)作為FoxO1蛋白表達強度，表達率（%）＝（實驗組表達強度／對照組表達強度）×100%。計算Akt／p-Akt、FoxO1／p-FoxO1蛋白的值。

1．3統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1IGF1對高糖下HUVEC生存率的影響

MTT結果顯示，設對照組培養(yǎng)48 h時的HUVEC細胞存活率為100%，則高滲組HUVEC的細胞存活率為93．71%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；高糖組細胞存活率為69．10%，明顯低于對照組（P＜0．05）。對照組細胞存活率與高滲組存活率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與對照組比較，高糖組細胞存活率明顯降低（t＝6．48，P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋IGF1組細胞存活率明顯增加（t ＝2．90，P＜0．05）；高糖＋IGF1＋AZD5363組細胞存活率未見明顯改變（t＝0．28，P＞0．05）。見表1。

表1　5組細胞生長比較（n＝4ˉ±s）

表1　5組細胞生長比較（n＝4ˉ±s）

與對照組比較：*P＜0．05；與高糖組比較：＃P＜0．05

組別A值　細胞存活率（%）0．86±0．07 100高糖0．59±0．04*69．10±4．65高糖＋IGF1 0．71±0．07＃83．30±8．14高糖＋IGF1＋AZD5363 0．60±0．01*69．77±1．16高滲對照0．80±0．04 93．71±4．65

2.2IGF1對高糖下HUVEC遷移的影響與對照組比較，高糖組細胞遷移抑制率顯著增高（t＝5．27，P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋IGF1組的細胞遷移抑制率顯著降低（t＝7．21，P＜0．05）；高糖＋IGF1＋AZD5363組的細胞遷移抑制率未見明顯改變（t＝0．31，P＞0．05）。高滲組中HUVEC遷移數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（t＝0．12，P＞0．05）。見表2。

2.3IGF1對高糖下Ak t、FoxO1 m RNA表達的影響高糖組FoxO1 mRNA的表達量與對照組比較明顯降低（6．00±0．65 vs1．14±0．15，t＝12．62，P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋IGF1組FoxO1 mRNA的表達量明顯增加（2．73±1．52 vs6．00±0．65，t＝3．42，P＜0．05），高糖＋IGF1＋AZD5363組FoxO1 mRNA的表達量明顯降低（2．97±1．04 vs 6．00±0．65，t＝4．27，P＜0．05）。5組AktmRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義（F＝0．39，P＞0．05）。見圖1。

表2　5組HUVEC細胞遷移的比較（n＝5±s）

表2　5組HUVEC細胞遷移的比較（n＝5±s）

與對照組比較：*P＜0．05；與高糖組比較：＃P＜0．05

組別　遷移數(shù)　遷移抑制率（%）45．8±12．4 0高糖16．0±2．3*65．1±5．02高糖＋IGF1 26．6±2．3＃41．9±5．02高糖＋IGF1＋AZD5363 16．6±3．6*63．8±7．86高滲對照45．0±8．9 1．7±1．94

2.4IGF1對高糖下Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表達的影響

與對照組比較，高糖組的FoxO1／p-FoxO1比值升高（4．50±1．15 vs 1．08± 0．14，t＝5．10，P＜0．05）；與高糖組比較，高糖＋IGF1組FoxO1／p-FoxO1比值降低（2．15±0．29 vs 4．50±1．15，t＝3．41，P＜0．05），高糖＋IGF1＋AZD5363組的FoxO1／p-FoxO1比值與高糖組差異無統(tǒng)計學意義（6．22±1．19 vs4．50±1．15，t＝1．81，P＞0．05），高滲組FoxO1／p-FoxO1比值與對照組差異無統(tǒng)計學意義（1．10±0．08 vs 1．08±0．14，t＝0．25，P＞0．05）。與對照組比較，高糖組的Akt／p-Akt比值升高（3．95±1．12 vs1．03±0．07，t＝4．50，P＜0．05）；與高糖組比較，高糖＋IGF1組Akt／p-Akt比值降低（1．92±0．35 vs3．95±1．12，t＝2．99，P＜0．05），高糖＋IGF1＋AZD5363組的p-Akt未見表達，Akt／p-Akt比值接近正無窮，高滲組Akt／p-Akt比值與對照組差異無統(tǒng)計學意義（1．12±0．06 vs 1．03±0．07，t＝1．71，P＞0．05）。見圖2。

3　討論

研究［6］表明，高糖可抑制細胞增殖，干擾細胞周期，誘發(fā)DNA損傷并可輕度加速細胞死亡，最終導致糖尿病血管病變的發(fā)生［7］。內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)失調被認為是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要始動因素［8］。糖尿病因血管并發(fā)癥導致的致殘致死率逐年升高，可能與糖尿病患者血管形成側支循環(huán)的能力下降有關［9］。研究［10］表明，IGF1對內(nèi)皮細胞有明確保護作用。本研究中結果顯示高糖對HUVEC增殖及移行有明顯的抑制作用，表明高糖具有細胞毒性作用；加入IGF1可明顯改善高糖的抑制作用。

內(nèi)皮細胞表達的FoxO1蛋白可激活其下游的多種因子，加速細胞凋亡［10］。為探究IGF1是否通過影響Akt-FoxO1通路的Akt活性進而調控FoxO1的表達，本研究在高糖＋IGF1基礎上進一步加入Akt阻滯劑AZD5363后顯示FoxO1／p-FoxO1未降低反而增高，Akt活化受抑制，p-Akt未發(fā)現(xiàn)表達，此時Akt／p-Akt無意義。其原因可能是在加入Akt阻滯劑后PI3K／Akt活化減弱，F(xiàn)oxO1去磷酸化，重新轉位于細胞核內(nèi)，去磷酸化的FoxO1在核內(nèi)發(fā)揮轉錄活性，抑制內(nèi)皮細胞的增殖移行功能。研究［11］表明PI3K-Akt-FoxO1信號通路在血管生成及內(nèi)皮細胞生長與存活中發(fā)揮重要作用。IGF1可激活PI3K／Akt，活化的Akt可使FoxO1發(fā)生磷酸化而發(fā)生核輸出，由核內(nèi)轉至細胞質中，失去轉錄活性，從而抑制細胞的凋亡［12］。本研究的結果與報道［12－13］一致，說明IGF1是通過Akt-FoxO1通路保護內(nèi)皮細胞增殖及移行的功能。為高糖下因FoxO1高表達所導致的內(nèi)皮細胞功能受損提供了直接依據(jù)。提示IGF1保護血管內(nèi)皮細胞的作用是通過調控FoxO1表達實現(xiàn)的。

本研究結果顯示，高糖抑制FoxO1 mRNA水平的表達，但在蛋白表達水平上FoxO1／p-FoxO1比值增高，說明高糖抑制了FoxO1的磷酸化。IGF1使高糖下FoxO1 mRNA的表達量明顯增加，高糖＋IGF1 ＋AZD5363后FoxO1 mRNA的表達量明顯降低，但FoxO1／p-FxoO1比值顯著升高，可能是其他信號通路對FoxO1蛋白表達的影響，具體信號通路機制有待進一步研究。5組中AktmRNA的表達未發(fā)現(xiàn)明顯變化，可能是IGF1對Akt的調節(jié)作用主要體現(xiàn)在蛋白表達水平。

本研究顯示高滲組對實驗結果未產(chǎn)生影響，排除高糖處理下的高滲狀態(tài)對內(nèi)皮細胞實驗結果的影響。本研究推測IGF1是通過激活Akt影響下游FoxO1／p-FoxO1水平進而調節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖及移行達到保護血管內(nèi)皮的作用，IGF1對減緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。FoxO蛋白在血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用和機制目前尚不清楚，進一步研究需通過核實動物模型來探索FoxO在體內(nèi)變化的病理生理學意義，加強對糖尿病血管病變發(fā)病機制的探討，為糖尿病血管病變的防治做出更大貢獻。

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中圖分類號R 587．1；R 587．2

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1373－05

基金項目：國家自然科學基金重點項目（編號：21331001）

作者單位：安徽醫(yī)科大學解放軍第306臨床學院內(nèi)分泌科，北京100101

作者簡介：騰佳麗，女，碩士研究生；劉彥君，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：liuyanj＠yeah．netmmol／L葡萄糖＋80 ng／ml IGF1＋5μmol／L AZD5363）；高滲組（20 mmol／L甘露醇＋5 mmol／L葡萄糖）。

Effects of IGF1 on proliferation and m igration of endothelial cells on high glucose

Teng Jiali，Liu Yanjun
（Dept of Endocrinology，306 Teaching Hospital of Anhui Medical University，Beijing100101）

AbstractObjectiveTo investigate the effects and the possiblemechanism of insulin like growth factor-1（IGF1）on proliferation and migration of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）in high glucose．Methods Cultured HUVEC were divided into 5 groups（control group，high glucose group，hypertonic group，high glucose＋IGF 1 group，high glucose＋IGF1＋AZD5363 group）．The proliferation was detected bymethyl thiazolyl tetrazolium（MTT），themigration was detected by transwellchamber．ThemRNA expressions of serine／threonine kinase（Akt）and FoxO1 were detected by real-time PCR．The protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere detected by immunohistochemisty．Resu ltsCompared with the control group，the rate of cell survival in high glucose group decreased significantly（P＜0．05），the transitional was decreased significantly（P＜0．05），the mRNA expression of FoxO1 was increased significantly（P＜0．05），the protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere increased．Compared with high glucose group，the cell survival rate and migration rate in high glucose＋IGF1 group were increased significantly，the mRNA expression of FoxO1 was decreased significantly（P＜0．05），the protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere decreased．Compared with high glucose group，the cell survival rate andmigration rate in high glucose＋IGF1＋AZD5363 group had no significant difference，themRNA expression of FoxO1 was decreased significantly（P＜0．05），the protein expressionsof FoxO1／p-FoxO1 had no significant difference．ThemRNA expression of Akt in five groups had no significant difference．ConclusionIGF1 can improve the proliferation andmigration of endothelial cell in high glucose．It shows that IGF1 acts through Akt to promote FoxO1 phosphorylation．

Key wordsinsulin-like growth factor 1；forkhead transcription factors；high glucose；endothelia cells；proliferation；migration