甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠海馬syntaxin-1的影響

李保山，查小雪，朱德發，康冬梅

甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠海馬syntaxin-1的影響

李保山1，查小雪2，朱德發2，康冬梅1

摘要目的觀察甲狀腺素（T4）聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥（甲減）大鼠的海馬內突觸前膜相關蛋白1 （syntaxin-1）表達的影響，探討甲減腦損傷及可能的恢復機制。方法44只SD大鼠隨機分為4組：對照組、甲減組、T4替代治療組及T4和多奈哌齊聯合治療組。通過飲水給予丙基硫氧嘧啶0．05%建立成年期大鼠甲減模型共6周。第5周開始，對照組腹腔注射等量生理鹽水，T4替代治療組每日給予左旋甲狀腺素（L-T4）6μg／100 g體重（BW）腹腔注射，聯合治療組每日給予6μg／100g BW L-T4腹腔注射及飲用水中加入0．005%多奈哌齊。采用免疫組織化學法和Western blot法分析4組大鼠海馬syntaxin-1的表達情況。結果與對照組比較，甲減組大鼠血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）、T4水平減低，促甲狀腺激素（TSH）水平升高（P＜0．01），海馬內syntaxin-1在CA1、CA3各層及齒狀區多形層（DG-PL）表達顯著增加（P＜0．01）；T4替代治療后，血清T3、T4和TSH水平恢復至正常水平，syntaxin-1蛋白的表達未完全恢復到對照組水平（P＜0．05）；T4聯合多奈哌齊治療后syntaxin-1蛋白表達與對照組比較差異無統計學意義。結論T4聯合多奈哌齊治療可以修復成年期甲減導致的腦損傷。

關鍵詞甲狀腺功能減退癥；甲狀腺素；多奈哌齊；syntaxin-1；海馬

成年期甲狀腺功能減退癥（甲減）可引起廣泛的中樞神經系統損傷和功能障礙，其機制可能與甲狀腺素（thyroxine，T4）的缺乏引起突觸可塑性改變有關［1］。突觸融合蛋白1（syntaxin-1）是特異性分布在神經細胞突觸前膜上的蛋白，通過與SNAP-25和synaptobrevin／VAMP蛋白聚合，進而形成被認為是神經突觸囊泡融合必要因子的SNARE核心復合體，與突觸可塑性有關［2］。海馬是負責認知和學習的神經結構基礎，主管空間記憶和事件記憶的形成。研究［3］顯示T4缺乏引起的認知功能障礙可能與海馬內的syntaxin-1水平升高有關，常規劑量的T4替代治療并不能使syntaxin-1水平完全恢復。該研究用丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）建立成年期大鼠甲減模型，旨在探討T4聯合多奈哌齊對成年期甲減大鼠海馬syntaxin-1表達水平的影響。

1　材料與方法

1．1實驗動物

成年雄性SD大鼠44只，12周齡，普通級，體重260～300 g，南京實驗動物中心提供。

1．2主要儀器及試劑

三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、T4放射免疫試劑盒購自北方生物技術研究所；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗山羊IgG購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的GAPDH單抗購自上海康成生物工程有限公司；山羊抗大鼠抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體、DAB試劑盒、SP-022生物素標記羊抗兔IgG超敏試劑盒均購自北京博奧森公司；DFM 296型16管放射免疫γ計數器購自合肥眾成機電技術開發有限公司；DXM 1200F光學顯微鏡購自日本尼康公司；JEDR801D形態學圖像分析系統購自江蘇捷達科技發展有限公司；PTU、左旋甲狀腺素（L-T4）及多奈哌齊購自美國Sigma公司；VE-180垂直電泳槽、EPS-300電泳儀、VE-186轉膜電槽購自上海天能科技有限公司。

1．3模型制備

大鼠適應性喂養1周，隨機分為4組，每組11只：對照組、甲減組、T4替代治療組（T4組）、聯合治療組（T4＋多奈哌齊組），用 0．05% PTU飲水6周建立成年期大鼠甲減模型。第5周起，對照組予以等量生理鹽水腹腔注射；T4組每日腹腔注射6μg／100 g體重（body weight，BW）L-T4；T4＋多奈哌齊組每日腹腔注射6μg／100 g BW T4并在飲用水中加入0．005%多奈哌齊。治療時間為2周。

1．4標本制備

血清制備：造模結束，稱重，水合氯

2015－05－07接收

230001

2安徽醫科大學第一附屬醫院老年內分泌科，合肥230022

腦標本制備：取血結束將大鼠斷頭處死，冰上取腦組織，右腦置于4%多聚甲醛溶液中固定待做免疫組化染色，左腦分離出海馬組織后于－80℃冰箱保存待做Western blot檢測。

1．5甲狀腺激素水平測定

采用放射免疫法檢測血清T3、T4、TSH水平，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書。

1．6免疫組化染色

采用超敏SP法行免疫組化檢測。通過光學顯微鏡拍攝海馬CA1、CA3和齒狀回（dentate gyrus，DG）區，采用生物圖像分析系統對DG區的分子層（ML）和多形層（PL），CA1區的起始層（SO）、放射層（SR）和腔隙分子層（SLM），CA3區的SO層、透明細胞層（SL）和SR層的syntaxin-1免疫反應產物進行光密度（optical density，OD）值分析，取其平均OD值。

1.7突觸小體提取及W estern blot法檢測

4℃

生理鹽水沖洗海馬組織，去除血液，濾紙拭干，玻璃勻漿器中勻漿，提取突觸小體后通過Western blot法檢測syntaxin-1蛋白，具體操作參照文獻［3］進行。分析條帶相對OD值，通過syntaxin-1與內參GAPDH的條帶OD值的比值來間接反映syntaxin-1的表達量。

1．8統計學處理

2　結果

2.1大鼠血清T3、T4及TSH水平

與對照組比較，甲減組大鼠血清T3、T4水平顯著降低，而TSH水平則顯著升高（F＝8．765、33．264、26．809，P＜0．01）；T4組大鼠血清T3、T4及TSH水平恢復至正常水平（P＞0．05）；聯合治療組大鼠血清T3、T4及TSH水平與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。見表1。

表1　各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較（n＝11，±s）

表1　各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較（n＝11，±s）

與對照組比較：**P＜0．01；與甲減組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01

組別　T3（nmol／L）　T4（nmol／L）　TSH（μIU／m l）0．81±0．02　48．88±1．12　1．05±0．12甲減　0．59±0．03**　19．08±1．67**19．68±3．03**T4　0．81±0．06＃＃　51．74±1．93＃＃　1．19±0．33＃＃T4＋多奈哌齊　0．75±0．07＃　52．81±1．94＃＃　1．04±0．13對照＃＃

2.2免疫組化法檢測大鼠海馬各區syntaxin-1表達

右腦組織切片，可見海馬結構清晰，染色較強（陽性著色呈棕黃色）。光鏡下觀察，syntaxin-1免疫反應產物分布在CA1、CA3和DG區各層，呈棕黃色顆粒，在甲減組中CA1、CA3所有層區和DG-ML層棕黃色顆粒更為密集，T4組的DG-ML層和DGPL層的syntaxin-1表達較對照組較高，而syntaxin-1表達水平在T4＋多奈哌齊聯合治療組與對照組基本相似。見圖1。

量化分析4組大鼠海馬內CA1、CA3及DG區各層syntaxin-1免疫反應產物的OD值，與對照組比較，甲減組海馬內CA1、CA3各層及DG-PL層表達顯著增加（F＝9．279、7．182、7．423、5．202、5．060、4．014、2．250、3．139，P＜0．05）。T4組DG-ML和DG-PL層syntaxin-1的OD值仍大于對照組（F＝1．524、1．848，P＜0．05）。T4＋多奈哌齊聯合治療組各層syntaxin-1的OD值更接近于對照組（P＞0．05）。見表2。

與對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

2.3W estern b lot法檢測大鼠海馬syntaxin-1表達變化

甲減組大鼠海馬內syntaxin-1表達水平明顯高于對照組，為對照組的1．38倍，差異有統計學意義（P＜0．05）；T4組和聯合治療組大鼠海馬內syntaxin-1表達水平分別為對照組的1．29倍和1．17倍，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。見圖2。

3　討論

本研究中，甲減組大鼠海馬突觸小體內syntaxin-1表達與對照組比較明顯增加，與研究［3］結論基本一致。syntaxin-1蛋白是參與中樞神經系統神經遞質釋放的重要調節蛋白之一，研究［4－6］顯示甲減大鼠模型中不同的組織syntaxin-1表達水平不一致。PTU誘導的甲減大鼠的腦前額葉中內syntaxin-1減少［4］，甲狀腺切除的甲減模型的腺垂體內syntaxin-1表達也下調［5］，而垂體切除的甲減模型腎上腺內syntaxin-1表達升高［6］。研究［7］表明甲減可以導致T4或甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）在不同的組織分布不同。提示syntaxin-1表達不一致可能與不同組織對甲狀腺激素缺乏的反應性不同有關。

T4替代治療是臨床治療甲減的經典方法，其標準是血清甲狀腺激素恢復至正常水平，對甲減腦損傷修復程度的研究［6，8］結論并不一致。研究［6］顯示常規T4替代治療后甲減導致的突觸相關蛋白未完全恢復至對照組水平，文獻［8］顯示常規T4替代治療后突觸相關蛋白表達水平完全恢復。本研究中T4組大鼠血清T3、T4及TSH水平恢復至正常水平，但是該T4水平下syntaxin-1表達未完全恢復至對照組水平。其原因可能是T4主要通過結合TRs發揮作用，與受體結合不夠有關。研究［9］顯示，在分別多次注射低劑量T3和單次注射大劑量T3后，TRs結合率分別是49%和86%。研究［10］顯示，與低劑量T4比較，大劑量T4能夠更有效的恢復樹突棘數量。因此，大劑量的T4替代治療可以增加TRs的結合率，從而發揮更大的生理效應。

T4替代治療的同時加用多奈哌齊后，研究顯示syntaxin-1的表達恢復至對照組水平。本研究首次顯示這一現象，目前多奈哌齊作用機制尚不明確，研究［11］證明多奈哌齊對神經退行性病變具有獨立的保護作用，能夠保護大腦皮層神經元，增加神經元樹突的長度和數量，避免海馬線粒體損傷和延緩阿爾茲海默病海馬萎縮。另外，多奈哌齊也被證明可以有效保護Tau蛋白病模型大鼠海馬內突觸相關蛋白和脊髓［12］。

綜上所述，成年期甲減導致海馬內syntaxin-1表達水平明顯增加，T4替代治療可以改善syntaxin-1表達水平，T4＋多奈哌齊聯合治療能夠完全恢復。提示T4聯合多奈哌齊對甲減導致的腦損傷的治療更有價值。

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中圖分類號R 581．2；R 322．81；R 446．6-3；R 977．14

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1390－04

基金項目：國家自然科學基金（編號：81272152）；安徽省科技計劃項目（編號：12010402134）

作者單位：1安徽醫科大學附屬省立醫院老年內分泌科，合肥

作者簡介：李保山，男，碩士研究生；康冬梅，女，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：kangdongmei2006＠sina．com醛0．3 m l／100 g麻醉后打開腹腔，采取腹主動脈血，3 000 r／min離心10 min，取血清置于4℃冰箱保存待測T3、T4和促甲狀腺激素（thyroid stim ulating hormone，TSH）。

Effects of thyroxin and donepezil on hippocampal syntaxin-1 expression in adult ratswith hypothyroidism

Li Baoshan1，Zha Xiaoxue2，Zhu Defa2，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，1The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001；2The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo observe the effects of thyroxine（T4）and donepezil on hippocampal syntaxin-1 expression in adulthypothyroidism rats，and clarify the possiblemechanism under the hypothyroidism-induced cognitive dysfunction．MethodsThe Sprague-Dawley rats were randomly classified into four groups：normal control，hypothyroid（PTU：0．05%，add to the dringking water），hypothyroid receiving levothyroxine replacement therapy（6μg／100 g body weight once daily，ip injection），and a combination of both drugs（levothyroxine：6μg／100 g；donepezil 0．005%）．Serum T3，T4 and TSH concentrationswere obtained using a radioimmunoassay kit．Protein levels of syntaxin-1 were determined by immunohistochemistry and Western blot．ResultsCompared to the control，the serum T3 and T4 levels of the hypothyroid group rats were significantly decreased，serum TSH elevated，syntaxin-1 in the hippocampus was significantly increased in CA1，CA3 and DG-PL regions．After levothyroxine or combined with donepezil treatment，serum T3，T4 and TSH were returned to the normal．But treatmentwith levothyroxine alone failed to normalize the expression of syntaxin-1．The level of syntaxin-1 was restored completely to the control group．ConclusionOur findings suggest that adult-onset hypothyroidism may induce increment of syntaxin-1 in the hippocampus，which could be restored preferably by T4 combined with donepezil treatment．

Key wordshypothyroidism；thyroine；dozepezil；syntaxin-1；hippocampus