早期膿毒癥大鼠心臟變化特點及卡維地洛預先干預作用的實驗研究

陳軍喜，孫　堅，管細紅，賈寶輝，夏芝輝，閆智杰，吳麗麗

早期膿毒癥大鼠心臟變化特點及卡維地洛預先干預作用的實驗研究

陳軍喜1，2，孫堅1，管細紅3，賈寶輝1，夏芝輝1，閆智杰1，吳麗麗1

摘要目的明確早期膿毒癥大鼠心臟變化特點及卡維地洛的預先干預作用。方法40只SD大鼠隨機分為膿毒癥組（S組）、膿毒癥卡維地洛預先干預組（CS組）、卡維地洛對照組（C組）和生理鹽水對照組（N組），CS組和C組給予卡維地洛10 mg／（kg·d）灌胃，4周后S組和CS組大鼠尾靜脈注射脂多糖（LPS）20 mg／kg制備膿毒癥模型，C組和N組注射等容量生理鹽水，24 h后檢測各組大鼠心率、血壓、血清磷酸激酸激酶（CK）、磷酸激酸激酶同工酶（CK-MB）、N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）濃度，心肌中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和三磷酸腺苷（ATP）的含量，觀察心肌形態學改變。結果卡維地洛可使正常大鼠心率減慢，心肌MDA含量下降、SOD含量升高。LPS可使大鼠心率增快，血清CK、CK-MB、NT-proBNP濃度和心肌MDA含量升高，心肌SOD和ATP含量降低；卡維地洛預先干預可減輕LPS所致大鼠的這些變化。4組大鼠血壓和心肌形態學變化差異無統計學意義。結論早期膿毒癥大鼠心率增快，心肌氧化應激，心臟功能受損，心肌能量生成減少。卡維地洛可增強大鼠抗氧化應激能力，卡維地洛預先干預可改善膿毒癥心肌能量代謝和心臟功能，可能與其抗氧化應激作用有關。

關鍵詞卡維地洛；膿毒癥；氧化應激；心臟功能

膿毒癥（sepsis）是感染與感染引起的全身炎癥反應［1］，進一步發展可導致感染性休克和多器官功能障礙綜合征，是當前危重病患者死亡的主要原因之一。心臟是膿毒癥易損的靶器官之一。現已知炎性反應和交感神經興奮、氧化應激等參與了膿毒癥的病理生理過程。心血管疾病的常用藥物卡維地洛作為第3代的β受體阻滯劑，兼有α受體阻滯劑、抗氧化、抗心律失常、抑制中性粒細胞浸潤等特性，經過臨床觀察，長期服用過卡維地洛的患者在發生膿毒癥時，治療效果多較其他未曾服用過此藥物的患者好，目前關于卡維地洛對膿毒癥心臟的影響研究也不多見，該研究旨在明確卡維地洛預先干預對早期膿毒癥大鼠心臟的影響。

1　材料與方法

1．1試劑與儀器

卡維地洛粉劑（美國Sigma公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（上海紀寧實業有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所）；solar3000多功能心電監護儀（美國GE公司）；羅氏2010電化學發光儀（北京英博科貿有限公司）；LG10-2．4A離心機（北京醫用離心機廠）；低溫高速離心機（D-37520，德國Sigma公司）；紫外分光光度計（美國HP公司）；電動玻璃勻漿機（寧波新芝公司）；液相色譜儀（鄭州國達儀器設備有限公司）；Olympus光學顯微鏡（BX51，日本奧林巴斯公司）；7170全自動生化分析儀、JEM-1230透射電鏡（日本日立分司）。

1．2動物分組及處理

40只雄性Wistar大鼠（南昌大學醫學院實驗動物科學部提供），體重250～300 g，隨機分為膿毒癥組（S組）、膿毒癥卡維地洛預先干預組（CS組）、生理鹽水對照組（N組）和卡維地洛對照組（C組），每組10只。①CS組大鼠給予卡維地洛10 mg／（kg·d）灌胃，1次／d；4周后尾

2015－04－30接收

2南昌大學醫學院研究生院，南昌3300313江西省人民醫院護理部，南昌330006

作者介紹：陳軍喜，女，博士研究生，副主任醫師；孫堅，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：cdsfysj＠163．com

靜脈注射LPS（20 mg／kg）制備膿毒癥模型；②S組大鼠給予卡維地洛等容量的生理鹽水灌胃，4周后尾靜脈注射LPS（20 mg／kg）制備膿毒癥模型；③N組大鼠給予與卡維地洛等容量的生理鹽水灌胃，尾靜脈注射與LPS等容量的生理鹽水；④C組大鼠給予卡維地洛10 mg／（kg·d）灌胃，1次／d；4周后尾靜脈注射與LPS等容量的生理鹽水。

1．3動脈血壓、心率測定

以注射LPS為時間起點，24 h后各組實驗大鼠于10%水合氯醛300 mg／kg腹腔注射麻醉后，行右股動脈插管、連接多功能心電監護儀測定動脈血壓、心率。

1.4心肌酶譜、血清N末端腦鈉肽前體（am inoterm inal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）檢測

測完血壓心率后，心臟穿刺取血4 m l，2 m l用于全自動生化檢測儀檢測心肌酶譜磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）和磷酸肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）；2 m l用于電化學發光法測定大鼠血清NT-proBNP。

1.5心肌組織處理及心肌SOD、MDA和ATP檢測

取血后立即開胸，迅速取出大鼠全心室，心尖處三分之一液氮凍存以備心肌三磷酸腺苷（andadenosine triphosphate，ATP）測定，中間三分之一福爾馬林固定以備病理檢查，心底三分之一組織勻漿后按試劑盒方法測定SOD和MDA含量。以反相高效液相色譜法測定ATP含量。

1．6病理檢查

光鏡標本經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟切片，HE染色后光鏡觀察，電鏡標本經3%戊二醛溶液固定，1%鋨酸后固定，乙醇－丙酮溶液逐級脫水，EPON812包埋，AO恒低溫切片機切片，醋酸鈾和枸櫞酸雙染色，電鏡觀察。4組標本處理、電鏡觀察條件等均相同。

1．7統計學處理

2　結果

2．1各組大鼠心率、血壓、心功能比較

與N組比較，S組大鼠心率明顯增快，而C組和CS組大鼠心率明顯減慢，S組和 CS組大鼠血漿CK、CK-MB和NT-proBNP濃度均明顯增高（P＜0．05）。與S組比較，C組和CS組大鼠血漿CK、CK-MB和NT-proBNP濃度均明顯下降（P＜0．05）。與C組比較，CS組血漿CK、CK-MB和NT-proBNP濃度均明顯增高（P＜0．05），而心率差異不大。4組中S組血壓最低，其次為CS組，再次為C組，但各組間血壓差異無統計學意義（P＞0．05）。見表1。

2.2各組大鼠心肌 MDA、SOD和ATP濃度比較

與N組比較，S組心肌MDA濃度明顯增加，SOD、ATP濃度明顯降低（P＜0．05）；CS組心肌ATP明顯下降（P＜0．05），但MDA和SOD濃度與N組差異無統計意義（P＞0．05）；C組心肌MDA濃度明顯下降，SOD濃度明顯上升（P＜0．05），而ATP濃度與N組差異無統計意義（P＞0．05）。與S組比較，CS組和C組心肌MDA明顯下降，SOD、ATP濃度上升（P ＜0．05）。與C組比較，CS組心肌ATP濃度明顯下降（P＜0．05），而心肌MDA和SOD濃度差異兩組差異無統計學意義（P＞0．05）。見表2。

表1　各組大鼠心率、血壓、心功能比較（n＝10，±s）

表1　各組大鼠心率、血壓、心功能比較（n＝10，±s）

與N組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與S組比較：＃＃P＜0．01；與CS組比較：△P＜0．05，△△P＜0．01

項目　N組　S組　CS組　C組　F值P值心率（次／分）　412±20　438±24**　365±16**＃＃　354±13**＃＃44．725　0．000收縮壓（kPa）　17．5±1．2　16．4±1．5　16．7±1．3　17．3±1．1　1．940　0．141舒張壓（kPa）　13．1±0．7　11．5±1．7　11．7±1．3　12．1±0．9　2．074　0．106 CK（U／L）　791．5±181．8　1 516．5±284．0**　1 033．4±143．2*＃＃　779．4±203．1＃＃△　27．097　0．000 CK-MB（U／L）　428．2±227．8　1 024．2±260．8**　687．7±283．9*＃＃　412．4±215．3＃＃△　13．328　0．000 NT-proBNP（pg／ml）　160．24±29．5　425．7±67．7**　342．3±65．3**＃＃　150．8±27．6＃＃△△70．876　0．000

2．3各組大鼠心肌病理改變

光鏡下心肌病理改變：N組和C組心肌細胞排列均勻整齊，橫紋清楚，細胞大小均一，心肌細胞間隙無變化。S組心肌細胞略肥大，心肌細胞排列稍紊亂，CS組心肌變化介于兩者之間。4組間差異并不顯著。

電鏡下心肌線粒體改變：C組與N組心肌細胞內線粒體結構完整，形態正常，S組心肌細胞內線粒體密度降低，體積增大，嵴數量減少，嵴膜清晰度下降，基質電子密度減低，部分粗面內質網增生，增生的粗面內質網常密集成片，形成指紋狀結構或圍繞變性的線粒體；CS組心肌細胞線粒體也表現為密度降低，體積增大，峭數量減少，基質電子密度降低，但程度較S組減輕。

表2　各組大鼠心肌 MDA、SOD、ATP含量比較（n＝10，±s）

表2　各組大鼠心肌 MDA、SOD、ATP含量比較（n＝10，±s）

與N組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與S組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01；與CS組比較：△P＜0．05

項目　N組　S組　CS組　C組　F值P值MDA（nmol／gprot）　7．624±1．812　12．471±2．840**　6．290±0．843＃＃　4．973±0．743**＃＃33．958　0．000 SOD（U／gprot）　0．399±0．042　0．298±0．085**　0．427±0．063＃＃　0．452±0．035**＃＃　9．664　0．000 ATP（μmol／g）　9．8±1．8　4．8±0．7**　5．9±1．0*＃　9．9±1．7＃＃△43．274　0．000

3　討論

膿毒癥患者中大約40%～50%會合并心臟功能不 全 （sepsis-inducedmyocardial dysfunction，SIMD），其中出現嚴重心功能衰竭（心衰）者約7%［2］。近30年來關于SIMD的研究沒有取得實際性進展，近年來有心肌保護作用的β受體阻滯劑在膿毒癥中的應用逐漸受到重視［3］。研究［4］顯示β受體阻滯劑可產生抗炎和心肌保護作用，如果預先給予β受體阻滯劑可降低膿毒癥大鼠的死亡率。

β受體阻滯劑可減慢心率、降低心肌耗氧、改善心肌供血。而快速心律失常作為膿毒癥的臨床特征，一直被認為是對心臟充盈不良、腎上腺素能神經刺激、發熱現象的反映。心率也常作為預測感染性休克患者存活率的重要因素［5］。本研究顯示預先給予β受體阻滯劑卡維地洛可明顯減慢大鼠在膿毒癥時的心率，而對血壓無明顯不良影響。

研究［6］顯示，膿毒癥時心肌受抑制情況常常存在，甚至進展到心功能不全。血清CK和CK-MB檢測對心肌損傷的初步篩查具有一定的特異性。其中CK-MB主要存在于心肌細胞，當心肌細胞受損時，CK-MB從心肌細胞內釋放，其升高程度與心肌損害程度呈正相關性。NT-proBNP是由心室釋放的心腦神經激素，可以更加敏感地反映心功能［7］，本實驗中大鼠在發生膿毒癥24 h時CK、CK-MB、NT-proBNP值均明顯升高，這個結果與臨床上觀察到的心肌受損后CK及CK-MB在6～24 h內急劇升高現象相符。卡維地洛對正常大鼠CK、CK-MB、NT-proBNP并無影響，但預先給予卡維地洛干預可降低膿毒癥大鼠CK、CK-MB、NT-proBNP值，不過這些心功能指標仍明顯高于正常水平，說明卡維地洛對早期膿毒癥大鼠心臟功能有一定的改善作用。

氧化應激是導致衰老和疾病的一個重要因素。膿毒癥時，由于氧化應激，自由基大量產生，抗氧化劑則相對減少或產生不足，細胞氧化損傷不可避免［8］。SOD是一種重要的抗氧化金屬酶，其活性可反映機體氧化應激水平、防御自由基損傷、保護生物膜免受自由基攻擊傷害的能力［9－10］。MDA是脂質過氧化的重要指標，是具有損害作用的氧化應激產物。膿毒癥大鼠心肌SOD含量明顯下降，MDA含量明顯增加，提示膿毒癥時，脂質過氧化反應增強，氧自由基生成大量增加，超過機體的清除能力，而卡維地洛能降低正常大鼠及膿毒癥大鼠心肌MDA含量，升高SOD含量，說明卡維地洛可減弱心肌脂質過氧化，增強心肌抗氧化能力。

機體各種生理活動最直接的供能物質—ATP合成于細胞線粒體內膜，而線粒體是對各種損傷最為敏感的細胞器之一，膿毒癥時，心肌線粒體合成的能量不能滿足心臟需要，或線粒體受損后能量合成不足，則會出現心臟功能障礙，甚至衰竭［11］。本研究證實在早期膿毒癥心臟組織中的ATP含量就明顯降低，卡維地洛并不影響正常心肌ATP含量，但預先給予卡維地洛可減輕膿毒癥心肌ATP含量的下降。

理論上心功能受損時心肌細胞形態也會有改變。膿毒癥時心肌ATP降低也應與線粒體功能受損密不可分。但本實驗結果顯示：膿毒癥心肌在光鏡下無明顯變化，電鏡下心肌線粒體雖有一定程度的腫脹、基質密度不均勻的降低，但變化并不顯著，卡維地洛預先干預對早期膿毒癥心肌形態的影響也不明顯。可能觀察的時機是膿毒癥早期，心肌受損的程度還不至于引起心肌細胞形態結構明顯改變。

綜上所述，膿毒癥早期表現為心率增快、心功能受損、心肌氧化應激、線粒體合成ATP減少可能是SIMD發生的一個病理生理機制；卡維地洛可減慢正常大鼠心率，提高抗氧化應激能力，預先給予卡維地洛可減輕膿毒癥時大鼠心肌 ATP合成障礙，改善心功能，其機制可能與其抗氧化應激有關。但卡維地洛并不能完全糾正膿毒癥時大鼠的心臟異常改變，由此推測除氧化應激外還有其它機制參與了SIMD的發生。

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中圖分類號R-33

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1430－04

基金項目：江西省衛生廳科技計劃課題（編號：20133083）；南昌市指導性科技計劃項目（編號：洪科發計字［2012］171號第15項）

作者單位：1南昌大學第四附屬醫院重癥醫學科，南昌330003

Experimental research on the characteristics of early septic rats’hearts and the advanced intervention effects of carvedilol

Chen Junxi1，2，Sun Jian1，Guan Xihong3，et al
（1Dept of Intensive Care Unit，The Forth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang330003；2Graduate School of Medical College of Nanchang University，Nanchang330031；3Dept of Nursing，Jiangxi Province People′s Hospital，Nanchang330006）

AbstractObjectiveTrying to demonstrate the characteristics of early septic rats’hearts changes and the advanced intervention effects of carvedilol．Methods40 SD ratswere random ly divided into 4 groups：sepsis group （S group），carvedilol-advanced-intervention sepsis group（CS group），carvedilol group（C group）and control group（N group）．The Sand CS groupswere injected lipopolysaccharide（LPS）（20mg／kg）into caudal vein to induce sepsis，the C and N groups were injected with the same volume of normal saline．The carvedilol had been orally administered 10mg／kg once a day for4 weeks prior to the injection of LPS in C and CSgroups．The Sand N groups were administered normal saline instead．After 24 hours，the items including heart rate，blood pressure，and the concentrations of serum creatine kinase（CK），creatine kinase isoenzyme-MB（CK-MB），amino-terminal pro-brain natriuretic peptide（NT-proBNP），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），andadenosine triphosphate（ATP）in myocardium were detected and compared，and the morphological changes of myocardium were observed．Resu ltsCarvedilol could slow down heart rate，decrease myocardial MDA concentration and increase myocardial SOD concentration in normal rats．LPS could increase rats’heart rate and concentrations of serum CK，CK-MB，NT-proBNP and MDA in myocardium，and it also could decrease concentrations of SOD and ATP in myocardium．Carvedilol-advanced-intervention could reduce the effectof the LPS in the rats．ConclusionSepsis in early stage could induce the rises of heart rate，oxidative stress，damages of cardiac function，and reduction ofmyocardial energy generation of the rats．However，carvedilol can enhance the ability of antioxidant of the rats．Carvedilol-advadanced intervention of sepsis could ameliorate myocardial energy metabolism and cardiac function thatmay be related to the antioxidant property of carvedilol．

Key wordscarvedilol；sepsis；oxidative stress；cardiac function