父源性十溴聯苯醚暴露下調雄性子鼠睪酮水平和精子數

戴瑞雪，翟金霞，任　征，丁承輝，林浩飛，李玉榮，李　俊

◇預防醫學研究◇

父源性十溴聯苯醚暴露下調雄性子鼠睪酮水平和精子數

戴瑞雪，翟金霞，任征，丁承輝，林浩飛，李玉榮，李俊

摘要目的觀察父源性（F0代雄性小鼠）十溴聯苯醚（PBDE-209）暴露對胎鼠（F1代）體格發育狀況及出生后70 （PND70）天F1代雄性子鼠臟器系數、睪酮水平、精子數和睪丸組織形態的影響。方法4周齡雄性小鼠，按小鼠每日體重進行灌胃染毒，隨機分為玉米油組（0 mg／kg）、低劑量組（100 mg／kg）、中劑量組（300 mg／kg）和高劑量組（500 mg／kg），連續染毒6周。染毒結束前1 d與健康雌鼠1∶2合籠，觀察F1代胎鼠體格發育和PND70天F1代雄性子鼠臟器系數、睪酮水平、精子數和睪丸組織形態變化。結果高劑量組F1代胎鼠體重、體長和肛殖距（肛門到生殖器距離）降低（P＜0．05），雌雄比增加（P＜0．05）；與玉米油組比較，高劑量組PND70天雄性子鼠睪丸系數、附睪系數、肝臟系數、腎臟系數、附睪尾精子數和血清睪酮水平明顯降低（P＜0．05）；雄性仔鼠HE染色顯示中、高劑量組精子數目減少，間質間隙明顯增寬，基底室出現空腔，支持細胞和間質細胞數減少等。結論F0代雄性小鼠暴露PBDE-209可能會影響F1代子鼠體格發育，還可能會使PND70天雄性子鼠的精子數、睪酮水平降低，以及睪丸形態結構發生改變。

關鍵詞PBDE-209；子鼠；胎鼠；PND70；睪酮；精子數

多溴聯苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）作為一種重要的阻燃劑被廣泛應用于紡織、塑料及電子等工業以及日用品中［1］。PBDEs共有209種同系物，常見的3種是五溴聯苯醚（penta-BDEs）、八溴聯苯醚（octa-BDEs）和十溴聯苯醚（PBDE-209）。在使用的阻燃劑總量中，PBDE-209超過80%。研究［2－4］表明，PBDE-209影響機體的免疫系統、神經系統、內分泌系統和生殖系統。研究［5］表明PBDE-209對子代也具有重要影響。王志新等［6］指出PBDE-209可導致小鼠體外受精率降低，影響受精卵的早期發育，呈劑量效應關系，但是關于F0代雄性小鼠暴露PBDE-209對其子代影響的研究極少。該研究利用PBDE-209作為受試物，通過對F0代雄性ICR小鼠經灌胃染毒，初步探討PBDE-209對F1代胎鼠體格發育及出生后70 （PND70）天雄性子鼠睪酮水平、精子數和睪丸組織形態的影響。

1　材料與方法

1．1主要試劑

PBDE-209（優級純，美國Alfa Aesar公司，貨號L04656）；睪酮ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）。

1．2動物

清潔級健康4周齡ICR雄性小鼠44只，體重27～32 g，8周齡雌性ICR小鼠88只，體重32～35 g，安徽省實驗動物中心提供。

1．3實驗設計

1．3．1F0代小鼠處理

實驗動物經適應性飼養1周，隨機分為4組，即玉米油組（0 mg／kg）、低劑量組（100 mg／kg）、中劑量組（300 mg／kg）、高劑量組（500 mg／kg），按小鼠每日體重進行灌胃染毒。小鼠自由飲食、飲水，環境溫度25℃左右，12 h光照／12 h黑暗。每天早上八時開始染毒，每日染毒1次，連續染毒6周。染毒結束前，與雌鼠合籠。

1．3．2吸收胎數、活胎數及F1代胎鼠生長發育與雌雄比的檢測

F0代染毒結束前，隨機選取各組雄鼠各6只，與雌鼠按1∶2比例合籠，合2 d休1 d，持續2周。次日九時前檢查雌鼠陰道，發現陰栓即為受孕0天。受孕第18天時，孕鼠脫頸椎處死，剖腹檢查，取胎鼠稱重和胎盤重，計算活胎總數、每窩活胎數等，并檢查外觀，測量體重、體長、尾長、肛殖距（肛門到生殖器距離），計算雌雄比。

1．3．3PND70天F1代子鼠的解剖與形態學

F0代小鼠染毒結束前，選取5只F0代小鼠，按上述方法進行合籠，交配結束后，棄去雄鼠和未懷孕的雌鼠，子鼠在出生后第4天，為維持F1子鼠營養均衡性，進行標準化，保持每窩8只子鼠（雌鼠4只，雄鼠4只），剔除不足8只的窩。子鼠在PND21天斷奶，將母鼠和雌性子鼠脫頸椎處死，雄性子鼠則繼續飼

2015－05－08接收

1．3．4F1代子鼠PND70天精子計數

按方法［7］計數精子，即在37℃小燒杯中剪碎附睪尾，使精子自由游出（約5 min），取適量精子懸液滴入計數板，計算精子總數。

1．3．5ELISA法檢測F1代子鼠PND70天血清睪酮的含量

取出存放于－80℃的血清樣本，室溫條件下放置30 min，試劑盒放置20 min；參照試劑盒說明書操作，計算出相應睪酮含量，由于睪酮值不呈正態分布，經對數轉換后進行分析。

1．4統計學處理

使用Excel對實驗數據進行建庫，采用SPSS 16．0軟件進行分析，數據以±s表示。各組數據間比較采用單因素ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗。

2　結果

2.1PBDE-209染毒雄性小鼠對與其合籠雌鼠的生育能力及F1胎鼠的影響

2．1．1PBDE-209染毒雄性小鼠對受孕數、生育率、吸收胎數、活胎數、每窩平均活胎數的影響

PBDE-209染毒組受孕數、生育率均高于玉米油組，每窩平均活胎數高于玉米油組，但差異無統計學意義（P＞0．05）。染毒組均出現吸收胎，低劑量組和高劑量組均為1例，中劑量組3例和1例發育遲緩，見表1。

表1　PBDE-209染毒雄性小鼠對受孕數、生育率、吸收胎數、活胎數和發育遲緩例數的影響

表2　PBDE-209染毒雄性小鼠對胎鼠體格發育的影響（±s）

表2　PBDE-209染毒雄性小鼠對胎鼠體格發育的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05；與中劑量組比較：＃P＜0．05

項目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝11）　　高劑量組（n＝8）體長（mm）　25．128 2±1．43　24．901 3±1．28　24．813 3±1．00　24．579 7±1．63*體重（g）　1．457 9±0．14　1．426 6±0．14　1．440 2±0．16　1．398 1±0．13*＃尾長（mm）　14．165 4±1．10　13．977 9±1．01　14．232 3±1．78　13．938 3±1．03胎盤（g）　0．099 0±0．02　0．177 8±0．13　0．103 2±0．02　0．121 2±0．13肛殖距（mm）　2．437 4±0．59　2．413 3±0．50　2．344 1±0．52　2．245 2±0．37*

2．1．2PBDE-209染毒雄性小鼠對F1代胎鼠體格發育及雌雄比的影響

高劑量組胎鼠體重、身長、肛殖距均明顯低于玉米油組，差異有統計學意義（F＝3．23、3．01、3．17，P＜0．05）；尾長和胎盤重量差異無統計學意義（F＝1．435、0．450，P＞0．05），見表2。平均每窩雌鼠數明顯增多、雄鼠數明顯減少、平均每窩雌雄比增加，差異無統計學意義（F＝2．03、1．73、2．82，P＞0．05），組間兩兩比較中顯示，與玉米油組比較，中劑量組和高劑量組的平均每窩雌鼠數和雌雄比差異有統計學意義（P＜0．05），高劑量組的平均每窩雄鼠數與玉米油組比較差異有統計學意義（P＜0．05），見表3。

2.2PBDE-209染毒雄性小鼠對其F1代雄性子鼠的影響

2．2．1PBDE-209染毒雄性小鼠對F1代PND70天雄性子鼠體重及臟器系數的影響

對PND70天雄性仔鼠的體重及各臟器系數進行分析，顯示體重均低于玉米油組（F＝2．93，P＞0．05），與玉米油組比較，高劑量組差異有統計學意義（P＜0．05）；腎臟系數（F＝2．36，P＞0．05）和肝臟系數（F＝5．53，P＜0．05）明顯降低，與玉米油組比較，高劑量組的腎臟系數和低、高劑量組肝臟系數差異有統計學意義（P ＜0．05），腦系數、脾系數和心系數差異無統計學意義（F＝1．98、0．95、2．95，P＞0．05），見表4。

2．2．2PBDE-209染毒雄性小鼠對F1代PND70天雄性子鼠睪丸系數、附睪系數、精子數和血清睪酮水平的影響

解剖PND70天F1代雄性子鼠，與玉米油組比較，中劑量組和高劑量組睪丸系數（F＝5．38，P＜0．01）和附睪系數（F＝10．82，P＜0．01）降低，且差異有統計學意義（P＜0．05）。F1代精子數和睪酮水平隨著染毒劑量的增加而降低，差異無統計學意義（F＝1．836、2．798，P＞0．05），高劑量組與玉米油組比較，差異有統計學意義（P＜0．05），見表5。

2．2．3PBDE-209染毒雄性小鼠對F1代PND70天雄性子鼠睪丸組織形態學的影響

玉米油組（圖1A）生精小管排列整齊，形態規則，精子數目較多，各級生精細胞排列有序而緊密，形態正常，睪丸支持細胞均勻分布在曲細精管周圍，排列緊密。低劑量組（圖1B）支持細胞數量和形態無明顯改變；中劑量組（圖1C）精子數目有所減少，睪丸支持細胞數量減少，細胞排列不緊密，支持細胞之間間隙變大。高劑量組（圖1D）精子數目減少，間質間隙明顯增寬，生精細胞間隙增大，支持細胞和間質細胞數減少。

表3　PBDE-209染毒雄性小鼠對胎鼠性別的影響（±s）

表3　PBDE-209染毒雄性小鼠對胎鼠性別的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05

項目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝11）　　高劑量組（n＝8）平均每窩雌鼠數（n）　5．714 3±2．50　7．500 0±2．39　8．363 6±2．66*　8．375 0±2．07*平均每窩雄鼠數（n）　7．571 4±1．81　6．500 0±2．39　5．818 2±1．54　5．500 0±2．00*平均每窩雌雄比　0．810 0±0．42　1．258 8±0．54　1．541 8±0．65*　1．787 5±0．99*

表4　PBDE-209染毒雄性小鼠對　F1雄性子鼠臟器系數的影響（±s）

表4　PBDE-209染毒雄性小鼠對　F1雄性子鼠臟器系數的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與低劑量組比較：＃P＜0．05；與中劑量組比較：△P＜0．05

項目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝9）　　高劑量組（n＝7）體重（g）　47．806 7±1．916 3　47．268 0±2．863 5　45．686 7±2．750 5　44．313 3±2．179 9*大腦系數（%）　0．753 4±0．000 4　0．725 6±0．000 9　0．820 3±0．000 9　0．759 6±0．000 8腎臟系數（%）　0．820 7±0．109 1　0．734 0±0．108 0　0．729 6±0．052 4　0．680 0±0．129 3*肝臟系數（%）　5．567 8±0．366 0　4．616 5±0．376 3△　5．381 4±0．750 4＃　4．614 5±0．703 4**△脾臟系數（%）　0．251 7±0．000 6　0．266 1±0．000 4　0．255 3±0．000 4　0．286 7±0．000 3心臟系數（%）　0．542 7±0．000 6　0．483 0±0．000 7　0．561 8±0．001 0 0．618 0±0．001 2

表5　PBDE-209染毒雄性小鼠對F1雄性子鼠睪丸系數、附睪系數、精子數、睪酮的影響（±s）

表5　PBDE-209染毒雄性小鼠對F1雄性子鼠睪丸系數、附睪系數、精子數、睪酮的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與低劑量組比較：＃P＜0．05

項目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝11）　　高劑量組（n＝8）體重（g）　47．806 7±1．916 3　47．268 0±2．863 5　45．686 7±2．750 5　44．313 3±2．179 9*睪丸系數（%）　0．338 4±0．034 1　0．310 3±0．032 1　0．295 1±0．011 3**　0．271 7±0．040 2**附睪系數（%）　0．121 4±0．013 4　0．111 0±0．007 9　0．102 7±0．007 9**　0．088 6±0．004 9**精子數（×106／ml）　34．730 0±3．251 7　31．800 0±2．041 2　31．230 0±3．636 4　29．560 0±1．847 5*睪酮（pg／m l）　2．667 5±0．045 4　2．660 8±0．059 5　2．612 2±0．075 6　2．550 0±0．035 7*＃

3　討論

我國是PBDEs生產和使用大國［8］。流行病學資料［9］顯示，PBDEs已經被證明在環境介質和生物樣本，包括人體生物樣本中檢測出，并且含量呈上升趨勢。PBDE-209屬于內分泌干擾物，對生物的生殖系統、神經系統和免疫系統有嚴重的損傷作用。對生殖系統的影響，特別是對雄性生殖系統的影響逐漸引起重視。前期研究［10］表明PBDE-209可以引起雄性小鼠睪丸和附睪臟器系數的降低，同時精子數和睪酮水平隨著暴露劑量的增加顯著降低。研究［11－12］表明親代低劑量暴露PBDE-209不僅影響F0代的生長和生殖，也會改變F1代的性腺、甲狀腺激素以及神經行為學的改變。與He et al［10］結果一致，該研究顯示染毒雄性小鼠致雌鼠受孕數增加，子鼠出生數量增加，并且各染毒組均出現吸收胎，中劑量組出現3例；染毒組胎鼠的體重、體長和肛殖距均低于玉米油組，并且雌鼠數明顯增加，雄鼠數明顯降低，平均每窩雌雄比顯著增加，這些結果表明F0代暴露PBDE-209可能對F1代胎鼠體格發育以及性別的形成具有影響。

目前為止，為數極少的關于F0代PBDE-209染毒對F1代影響的研究中F0代處理方式集中在孕期和孕前期暴露。比如梁辰等［5］報道，孕期暴露PBDE-209可影響雌性子代大鼠的生殖發育。本研究主要是用PBDE-209染毒雄性小鼠，在對雌鼠沒有繼續染毒的情況下觀察F1代PND70天雄性小鼠的發育、睪酮水平、精子數和睪丸形態學的影響。結果顯示體重和經體重校正后的睪丸系數、附睪系數、腎臟系數、肝臟系數顯著降低；大腦系數、脾臟系數和心臟系數增加，差異無統計學意義。以上結果表明PBDE-209染毒雄性小鼠可能對PND70天子鼠的臟器系數具有一定的影響。進一步研究顯示精子數和血清睪酮含量顯著降低，支持細胞和間質細胞數減少，支持細胞與生精細胞間隙增寬。Tseng et al［13］指出PBDE-209孕期暴露可引起PND71天的雄性子鼠精子H2O2含量增加以及DNA損傷。王志新等［14］發現外源性暴露PBDE-209可使小鼠精子DNA損傷，引起精子DNA鏈斷裂，呈劑量－效應關系。但目前關于PBDE-209染毒F0代雄性小鼠對F1代影響的機制尚不清楚。

綜上所述，PBDE-209染毒雄性F0代小鼠可能對與其合籠雌性小鼠的生育能力及F1代胎鼠體格發育產生影響，出現吸收胎和發育遲緩，F1代胎鼠的體格發育指標低于玉米油組，雌雄比增加，并且F1代PND70天雄性子鼠的精子數和血清睪酮水平降低，由于本研究樣本量有限，需要大樣本量作進一步的研究，其機制還有待深入探討。

參考文獻

［1］Labunska I，Harrad S，Wang M，etal．Human dietary exposure to PBDEs around E-waste recycling sites in Eastern China［J］．Environ Sci Technol，2014，48（10）：5555－64．

［2］李祥，湯艷，李華，等．BDE-209對雌性大鼠卵巢抗氧化系統的影響［J］．工業衛生與職業病，2012，38（1）：1－3．

［3］Zhang Z，Zhang X，Sun Z，et al．Cytochrome P450 3A1 mediates 2，2’，4，4’-tetrabromodiphenyl ether-induced reduction of spermatogenesis in adult rats［J］．PLoSOne，2013，8（6）：e66301．

［4］Lv Q Y，Wan B，Guo L H，etal．In vitro immune toxicity of polybrominated diphenyl ethers onmurine peritonealmacrophages：apotosis and immune cell dysfunction［J］．Chemonsphere，2015，120：621－30．

［5］梁辰，何曉雯，謝欣，等．十溴聯苯醚孕期暴露對雌性子代大鼠生殖發育的影響［J］．上海交通大學學報（醫學版），2012，32（11）：1461－5．

［6］王志新，段華英，王玲，等．十溴聯苯醚對小鼠受精卵發育的影響［J］．中山大學學報（醫學科學版），2011，32（1）：51 －5．

［7］Ernest S R，Wade M G，Lalancette C，et al．Effects of chronic exposure to an environmentally relevant mixture of brominated flame retardants on the reproductive and thyroid system in adult male rats［J］．Toxicol Sci，2012，127（2）：496－507．

［8］翟金霞，王興華，張照祥，等．十溴聯苯醚（BDE-209）染毒對雄性BALB／c小鼠睪丸毒性作用［J］．中華勞動衛生職業病雜志，2011，29（4）：294－8．

［9］Zou Y，Christensen E R，ZhengW，etal．Estimating stepwise debromination pathways of polybrominated diphenyl ethers with an analogue Markov Chain Monte Carloalgorithm［J］．Chemosphere，2014，114：187－94．

［10］He J，Yang D，Wang C，et al．Chronic zebrafish low dose decabrominated diphenyl ether（BDE-209）exposure affected parental gonad development and locomotion in F1 offspring［J］．Ecotoxicology，2011，20（8）：1813－22．

［11］Koenig C M，Lango J，Pessah I N，et al．Maternal transfer of BDE-47 to offspring and neurobehavioral development in C57BL／6Jmice［J］．Neurotoxicol Teratol，2012，34（6）：571－80．

［12］Ernest SR，WadeMG，Lalancette C，etal．Effectsof chronic exposure to an environmentally relevantmixture of brominated flame retardantson the reproductive and thyroid system in adultmale rats ［J］．Toxicol Sci，2012，127（2）：496－507．

［13］Tseng LH，Hsu PC，Lee CW，etal．Developmental exposure to decabrominated diphenyl ether（BDE-209）：effects on sperm oxidative stress and chromatin DNA damage inmouse offspring［J］．Environ Toxicol，2013，28（7）：380－9．

［14］王志新，段華英，王玲，等．外源性BDE-209對小鼠精子DNA的損傷［J］．南方醫科大學學報，2011，31（1）：108－12．

中圖分類號R 994

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1438－05

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：1408085MH192）；安徽醫科大學博士科研資助基金（編號：XJ201201）

作者單位：安徽醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學系，合肥230032

作者簡介：戴瑞雪，女，碩士研究生；翟金霞，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhaijinxia＠sina．com養至PND70天，眼球取血，然后脫頸椎處死，冰浴上取睪丸、附睪、腦、肝、腎等臟器并稱量重量，同時取附睪尾計數精子，睪丸行HE染色。

Decrease of testosterone levels and sperm count in m ale offspring by paternal exposed to decabromodiphenyl ether

Dai Ruixue，Zhai Jinxia，Ren Zheng，et al
（Dept of Occupational and Environmental Health，School of Public Health，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo observe the physical developmentof fetalmice（F1fetalmice）and the organ coefficient，testosterone levels，sperm count and testicular tissuemorphology of F1male offspring after birth 70（PND70）days by the paternal（F0male mice）exposing to decabromodiphenyl ether（PBDE-209）．Methods4-week-old male mice were infected according to the daily body weight and divided into the corn oil group（0 mg／kg），low dose group（100 mg／kg），middle dose group（300 mg／kg）and high dose group（500 mg／kg）random ly．Mice wereexposed to PBDE-209 by gavage for 6 weeks．They were put togetherwith healthy femalemice for copulation as the ratio 1∶2 before the end of gavage．To observe the physical development of F1fetalmice and the organ coefficient，testosterone levels，sperm countand testicular tissuemorphology of F1male offspring after birth 70（PND70）days．ResultsIn the high dose group，the body weight，length and anogenital distance（distance between the anus to the genitals）of F1fetalmice were reduced（P＜0．05），and the ratio of female versemale increased（P＜0．05）；compared with the control group，the testis coefficient，epididymis coefficient，liver coefficient and kidney coefficient of the high-dose group PND70 male offspring were decreased（P＜0．05），and the sperm count in the tail of epididymal and serum testosterone levels were reduced significantly（P＜0．05）；in the middle and high dose groups，the number of sperm countwas reduced，the interstitial spacewaswidened significantly，vacuolus appeared in the base compartment，and the number of sertoli cells and leydig cellswas reduced in themale fetalmice by HE staining．ConclusionF0malemice exposed to PBDE-209 may affect the physical development of F1fetalmice，andmay cause the reduction of sperm count and testosterone levels and testicularmorphological change of PND70 male offspring．

Key wordsPBDE-209；offspring；fetalmice；PND70；testosterone；sperm count