凝血酶敏感激素蛋白酶4／5在骨性關節炎滑膜中的表達及意義

王　京，張琪琪，胡　勇，魏　偉

Wang Jing，Zhang Qiqi，Hu Yong，et al（Dept of Orthopedicst，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei　230022）

凝血酶敏感激素蛋白酶4／5在骨性關節炎滑膜中的表達及意義

王京1，張琪琪1，胡勇1，魏偉2

摘要目的研究凝血酶敏感激素蛋白酶4／5（ADAMTS4／5）在骨性關節炎（OA）滑膜組織及滑膜細胞中的表達及意義。方法取6例正常者滑膜組織和6例OA患者滑膜組織，Western blot法檢測標本中ADAMTS4／5的表達，離體培養正常者滑膜細胞。白介素-1β（IL-1β）刺激正常滑膜細胞，測定滑膜細胞中ADAMTS4／5的表達量；IL-1RA（IL-1β阻滯劑）抑制IL-1β后，測定滑膜細胞中ADAMTS4／5的表達量。結果ADAMTS4／5在OA患者滑膜組織中表達較正常者滑膜組織均顯著增加；IL-1β刺激滑膜細胞后，ADAMTS4／5升高，IL-1RA可明顯降低IL-1β誘導的滑膜細胞中ADAMTS4／5的表達。結論IL-1β可以按照劑量依賴方式正向調節ADAMTS4／5的表達；ADAMTS4／5和IL-1β在OA病變機制中發揮重要的作用。

關鍵詞骨性關節炎；ADAMTS4／5；IL-1β；IL-1RA；滑膜細胞

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以骨質丟失、骨贅形成、關節畸形等為主要特征的退行性關節病，發病機制尚不明確。目前的觀點凝血酶敏感激素蛋白酶4（aggrecanas4，ADAMTS4）主要是由炎性細胞因子誘導產生［1］。凝血酶敏感激素蛋白酶5 （aggrecanas5，ADAMTS5）主要是由病理性軟骨細胞和滑膜成纖維表達［2］。ADAMTS4／5被認為能引起滑膜炎癥性反應，最終導致OA的發生。白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）是在滑膜炎癥反應中比較重要的一種細胞因子，其作用是能夠刺激滑膜細胞增殖，產生相關降解酶，從而破壞關節軟骨，最終引起關節炎癥，與OA的發生發展有著密切的關系。目前ADAMTS4／5在滑膜組織和細胞中的表達仍存在爭議。該研究采用Western blot法分別測定滑膜組織、細胞蛋白表達量，旨在探討ADAMTS4／5、IL-1β和OA之間的關系。

1　材料與方法

1．1病例資料

收集2012年9月～2013年1月于安徽醫科大學第一附屬醫院骨科就診的OA患者的滑膜組織6例（OA組），另選因意外損傷導致股骨頸骨折患者的滑膜組織6例（對照組）。其中男4例，女8例；年齡35～85（57．50±7．35）歲。

1．2主要儀器

SDS-PAGE電泳儀和轉膜儀（美國Bio-Tek公司）；－80℃超低溫冰箱（日本三洋公司）；Bioshine ChemiQ 4600熒光及化學發光成像系統（中國Bioshine公司）；酶聯免疫檢測儀、組織勻漿器（上海歐翔科學儀器有限公司）；恒溫箱（上海一恒科技有限公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；搖床、離心機（安徽醫科大學臨床藥理研究所提供）。

1．3主要試劑

20%FBS培養液、IL-1β、白介素1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA）、0．1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培養基、去離子水、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、PVDF膜、TEMED原溶液、Tris、脫脂奶粉、PBS緩沖液和吐溫PBS緩沖液（上海南基生物科技有限公司）；兔抗ADAMTS4／5多克隆抗體（英國Abcam公司）；山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA緩沖液和SDS-PAGE加樣緩沖液（中國碧云天生物技術研究所）；ECL顯影液（美國Thermo公司）。

1．4方法

1．4．1滑膜細胞的分離、培養以及傳代

采用組織塊法，標本在無菌條件下處理后（滴加2滴含20% FBS培養液），將組織塊剪碎成約1 mm×1 mm× 1 mm大小，使用20%FBS處理后放置于培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中約3 h。翻轉培養瓶，使組織塊浸沒于培養液中，繼續培養當檢測細胞數值達到1×105個／ml時，傳代至 24孔培養板中待用。

1．4．2組織蛋白鑒定

1．4．2．1組織的取材

經術前談話已經獲得患者本人和家屬同意后，標本取自安徽醫科大學第一附屬醫院關節外科中心髖、膝關節置換的患者，共取出12例，標本為新鮮滑膜組織，帶無菌手套后使用手

2015－05－26接收

2安徽醫科大學藥理研究所，合肥230032

1．4．2．2組織蛋白提取

取對照組及 OA組各1 g，電子稱精確測量后平均分為4組（加入約2．5 m l的蛋白裂解液），使用組織勻漿器小心充分研磨（冰浴條件下），直至完全研磨至無固態物質存留即加入1．5 ml EP管標序。分別取40μl蛋白樣品至標序為1、2、3、4的EP管中，1、3號設為對照組，2、4號設為 OA組。加 Loading Buffer緩沖液煮沸10 min，冷卻后，于－80℃冰箱保存。

1．4．2．3細胞蛋白提取

滑膜細胞傳代至 60 mm培養皿中，待細胞充分融合，收集細胞，棄培養基，加入PBS 2 m l清洗培養皿1次，棄PBS。0．05%胰酶2 m l處理，37℃溫育1 min。鏡下觀察細胞變形后，將細胞轉移至一個1．5 ml EP管中，10 000 r／min離心3 min，4℃條件下棄EP管上清液，1 m l預冷的PBS清洗沉淀，10 000 r／min離心3 min，4℃條件下PBS清洗1次棄上清液，－80℃凍存待裂解，向細胞沉淀中加入200μl RIPA緩沖液，混勻后冰上放置40min，10 000 r／min離心15 min，4℃，將上清液（約250μl）轉移至一個新的EP管中。

1．4．2．4Western blot法測定滑膜組織蛋白表達水平

10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，轉移至PVDF膜上，37℃條件下5%脫脂牛奶封閉1．5 h，用ADAMTS4／5抗體（1∶200），β-actin（1∶1 000）孵育，4℃過夜，加入山羊抗兔標記二抗（1∶10 000），37℃溫育1 h，ECL底物化學發光顯影，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對應的β-actin蛋白灰度值比較，計算兩者比值。

1．4．2．5Western blot法檢測滑膜細胞蛋白表達水平

采集的蛋白樣品（－20℃）凍存后，10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白質，轉移至PVDF膜上，37℃條件下5%脫脂牛奶封閉2 h，用ADAMTS4／5抗體（1∶100），β-actin（1∶500）孵育，4℃過夜，加入山羊抗兔標記二抗（1∶5 000），37℃溫育0．5 h，ECL底物化學發光顯影，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對應的β-actin蛋白灰度值比較，計算兩者比值。

1．4．3IL-1β與IL-1RA對滑膜細胞蛋白表達的測定

1．4．3．1IL-1β誘導對照組滑膜細胞

對照組滑膜細胞貼壁生長后，更換DMEM培養基（含0．1%BSA）繼續培養24 h，更換DMEM培養基（含1、10 ng／m l IL-1β），各濃度分別做8個復孔，分別為試驗組2、3；對照組為試驗組1。作用時間為6 h，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對應的βactin蛋白灰度值比較，計算兩者比值。

1．4．3．2IL-1RA降低IL-1β誘導水平

試驗組1、試驗組4（IL-1RA 500 ng／ml＋IL-1β10 ng／m l）、試驗組5（IL-1RA 500 ng／ml＋IL-1β10 ng／ml）。IL-1RA預處理作用時間為2 h，后用IL-1β繼續作用24 h，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對應的β-actin蛋白灰度值比較，計算兩者比值。

1．5統計學處理

2　結果

2.1滑膜組織中ADAM TS4／5的表達情況

OA組ADAMTS4／5的表達明顯高于對照組（F＝422．911、905．154，P＜0．01）。提示ADAMTS4／5在OA滑膜中高表達。見圖1。

2．2滑膜細胞蛋白表達水平

IL-1β作用滑膜細胞后，隨著劑量的增加，ADAMTS4的表達量增加但不明顯，ADAMTS5的表達量明顯增加（F＝60．100，P＜0．01），提示ADAMTS5的表達隨著IL-1β刺激量增加呈逐漸升高的趨勢（P＜0．01）。見圖2。

2．3正常滑膜細胞的形態

倒置顯微鏡下觀察，細胞核呈卵圓形，位于細胞中間，邊界清楚，核仁清晰可見；IL-1β作用后細胞數量發生明顯變化，而使用IL-1RA后數量未見明顯變化。見圖3。

2.4IL-1RA對IL-1β誘導水平的影響

IL-1β刺激人滑膜細胞后，ADAMTS4／5的表達量均高于對照組，使用IL-1RA抑制后，ADAMTS4和ADAMTS5的表達量均明顯降低，結果顯示IL-1RA可以降低IL-1β誘導水平。見圖4。

3　討論

OA的產生是一個多種因素共同參與作用的過程，目前治療方法是使用以緩解疼痛及對抗炎癥反應的藥物與為主，如非甾體抗炎藥或類固醇激素。但目前國內外尚無根治OA的方法，并且在治療OA上存在許多爭議，因此找到治療OA的新靶點或者靶向治療藥物顯得尤為重要。

研究［3］顯示，在體外培養的正常人或動物的滑膜細胞中僅有少量的IL-1β，但是在人OA的滑膜組織提取的細胞上清液中卻能檢測出高表達的IL-1β。ADAMTS又被稱作為蛋白聚糖酶，是國內外這些年克隆提取的新型酶類，屬新的金屬蛋白酶家族成員［4］，是帶有凝血酶敏感蛋白樣模體的裂解素。在白介素1家族中IL-1β與IL-1RI（白細胞介素1受體I型）的結和力最低，但IL-1RA與IL-1RI的結合力幾乎不可逆轉，因此IL-1RA被認為是IL-1β較為有效的抑制劑［5］。ADAMTS的家族成員中，特別是存在于人或動物軟骨和滑膜組織中的蛋白聚糖酶1／2，又被分別稱為ADAMTS4／5。被認為是可以降解關節軟骨的一類。

研究［6－7］表明，IL-1對 ADAMTS5 mRNA的表達沒有或僅有輕微影響。在動物實驗方面用IL-1或維甲酸處理牛滑膜，并不改變ADAMTS4／5 mRNA的表達［2］。在人滑膜細胞培養中，Bondeson et al［8［9］報道在軟骨細胞的培養中，用IL-RA可以阻滯IL-1和腫瘤壞死因子-α的誘導作用。本研究結果顯示ADAMTS4／5在OA滑膜組織中均高表達；IL-1β可誘導人正常滑膜細胞的增殖，能夠產生高表達的ADAMTS4／5；不同劑量的IL-1β作用滑膜細胞后，ADAMTS4表達量增加不明顯，ADAMTS5表達的量逐漸增加，提示兩種酶表達水平有差異；IL-RA能夠抑制IL-1β誘導細胞蛋白表達，但因為沒有設立精確時間點及IL-1β作用時間不同導致統計分析結果出現不一致。

研究［10－12］顯示 p38-TAK1-NF-κB信號通路可能參與調節ADAMTS4／5的表達。由于經費及時間限制，未能進一步討論。找出信號通路中的作用靶點和特異性抑制劑，為治療OA提供新的依據顯得尤為重要。在OA的研究中，仍有很多問題尚待解決。ADAMTS4和ADAMTS5在軟骨中的表達及相關機制，在人體其他組織中蛋白聚糖酶起到的作用等均有待于進一步研究證實。

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Wang Jing，Zhang Qiqi，Hu Yong，et al
（Dept of Orthopedicst，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

中圖分類號R 684．3

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1475－04

基金項目：國家自然科學基金（編號：81173075）

作者單位：1安徽醫科大學第一附屬醫院骨科，合肥230022

作者簡介：王京，男，碩士研究生；胡勇，男，博士研究生，副教授，責任作者，E-mail：hy．in163＠163．com術刀片剔除脂肪等非滑膜組織后，所取標本分為兩組，所有標本袋上需注明患者詳細信息。正常組（供細胞蛋白鑒定）和OA組（供組織蛋白鑒定）分別放置于無菌EP管及含生理鹽水的標本袋中，后于－80℃冰箱凍存。

The expression and significance of thrombin-sensitive hormone protease4／5 in osteoarthritis synovial

AbstractObjectiveTo research the expression of thrombin sensitive hormone protease 4（ADAMTS4／5）in the OA synovial tissue and cells．Methods6 cases of OA synovial tissue and 6 cases of normal synovial tissue were taken during the operation．The expression quantity of specimen ADAMTS4／5 in cases wasmeasured by Western blot，respectively．The normal group and OA group synovial cellswere cultured in vitro．The normal group synovial cellswere induced by IL-1βor IL-1βblockers（IL-1RA）．The expression quantity of ADAMTS4／5 weremeasured by the supernatant fluid．ResultsADAMTS4／5 in OA synovial tissue expressed significantly than the normal group．The group of IL-1βwas obviously higher，IL-1RA could block IL-1βand induce synovial cells to produce ADAMTS4／5．ConclusionADAMTS4／5 and IL-1βplay an important role in synovial tissue inflammatory change；IL-1βcan be in accordance with the dose-responsemanner positive adjustment ADAMTS4／5 expression．

Key wordsosteoarthritis；ADAMTS4／5；IL-1β；IL-1RA；synovial cells