GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比較

吳晶晶，仝佳，陳娟，袁靖，田潔，湯新逸，王勝軍

（江蘇大學醫學院檢驗醫學研究所，江蘇鎮江212013）

GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比較

吳晶晶，仝佳，陳娟，袁靖，田潔，湯新逸，王勝軍

（江蘇大學醫學院檢驗醫學研究所，江蘇鎮江212013）

目的：對3種單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism，SNP）分型方法進行比較，選擇準確有效的SNP分型方法對GITRL SNP-rs2236876A/G進行基因分型。方法：采用Taqman-MGB探針法，限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）法和直接測序法對GITRL SNP-rs2236876A/G進行分型并比較。結果：PCR-RLFP法分型結果直接通過電泳圖可見，適合少量的實驗對象；Taqman-MGB探針法通過不同的熒光區分不同的基因型，適合大量的實驗對象；直接測序法交由測序公司測定，樣本數量浮動范圍較大，費用較高。結論：Taqman-MGB探針法適用于GITRL基因rs2236876A/G基因分型，PCR-RFLP法適用于基因分型結果的驗證，直接測序法適用于鑒定有爭議的PCR-RFLP法的驗證結果。

Taqman-MGB探針；單核苷酸多態分型；PCR-RFLP；GITRL

快速經濟地對糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體配體（GITRL）基因SNP-rs2236876進行分型，對于實驗室研究SNP而言非常重要。目前，SNP分型的方法有多種，如探針法，限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）等，為了配合研究SNP的大量樣本分析，我們需要一種經濟、精確、有效的SNP分型方法。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料 常規PCR試劑（TaKaRa公司），PCRRFLP所用TaiⅠ限制性內切酶（TaKaRa公司），Taqman-MGB探針所用的組分（上海閃晶）。

1.1.2 儀器 定量PCR擴增儀CFX 96 Real Time system（Bio-Rad公司），凝膠成像及分析系統（北京賽智公司），電泳儀（Bio-Rad公司），低溫臺式高速離心機（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 確立用于比較實驗方法的標準品 提取10例不同個體的外周血基因組DNA，提取方法參考文獻［1］。對GITRL基因SNP-rs2236876A/G進行引物設計，設計的原則是將rs2236876A/G突變的位點包含在PCR產物內，并保證與引物上下端有一定的距離。PCR-RFLP所設計的引物序列見表1。用引物對所提取的10例基因組DNA進行常規PCR，產物交由上海英濰捷基公司測序，分析PCR結果，選擇rs2236876A/G 3種不同基因型（AA，AG，GG）的樣本作為標準品進行下一步分析。

表1 PCR-RFLP與Taqman-MGB探針的引物序列

1.2.2 基因分型方法

1.2.2.1 PCR-RFLP法［2］將選出的3例不同基因型的標準品進行常規PCR，針對rs2236876A/G選擇能識別于該位點的限制性內切酶TaiⅠ，然后對PCR產物進行限制性內切酶反應，酶切結果行瓊脂糖凝膠電泳，然后EB染色，最后在紫外凝膠成像儀中觀察酶切結果，根據酶切結果的不同進行基因分型。具體反應體系如下：10×PCR反應緩沖液2 μL、dNTP 1.6μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4 μL、DNA聚合酶0.2μL。

1.2.2.2 Taqman-MGB探針法［3］設計Taqman-MGB探針法所需的引物及探針，引物和探針序列見表1。在熒光定量PCR儀上選擇兩種熒光（FAM，VIC）進行基因分型。具體反應體系如下：雙蒸水8 μL、TaqMan?SNP探針0.5μL、TaqMan?SNP引物0.5μL、TaqMan?Genotyping Master Mix 10μL、模板1.0μL。

1.2.2.3 直接測序法 將PCR產物直接送至上海英濰捷基公司進行直接測序，獲得結果后，通過Chromas軟件進行測序結果的分析。將分析結果在NCBI數據庫中進行比對，確認基因型。

2 結果

2.1 PCR-RFLP法進行基因分型的結果

由圖1可見3種不同的酶切結果，rs2236876GG樣本被完全酶切，rs2236876AG樣本部分被酶切，而rs2236876AA樣本完全未被酶切，與預期結果相符。

圖1 PCR-RFLP法對GITRL基因rs2236876進行基因分型的結果

2.2 Taqman-MGB探針法進行基因分型的分型圖譜

根據FAM和VIC兩種不同的熒光與不同基因型的結合分析，方塊點所代表的基因型是rs2236876-GG，三角形點所代表的基因型是rs2236876-AG，圓形點所代表的基因型是rs2236876-AA，與預期結果相符合。見圖2。

圖2 Taqman-MGB探針法對GITRL基因rs2236876進行基因分型的熒光分型圖

2.3 直接測序法進行基因分型的測序結果

從圖3中序列的峰圖譜可看出，在rs2236876A/ G位點處可見3種不同的峰圖譜，rs2236876AG所對應的峰圖譜中可見兩種不同顏色的混合峰，而rs2236876GG和rs2236876AA分別對應的是不同顏色的單一峰，與預期結果相符合。

圖3 直接測序法進行基因分型的測序結果分析圖譜

2.4 3種基因分型方法的費用和耗時比較

預估計實驗所要檢測約400個樣本的SNP，因此需要考慮費用和時間各方面因素，故需選擇一種經濟、快捷、準確性較高的基因分型方法。綜合考慮，對3種不同的基因分型方法從費用和耗時的角度進行了比較，見表2。由表可知，PCR-RFLP法進行基因分型費用低，但耗時較長；TaqMan-MGB法費用較高，但耗時很短；直接測序法費用較高，耗時較長。

表2 不同基因分型方法的費用和時間比較

3 討論

目前對基因多態性的研究越來越多，臨床上多種疾病都與SNP有關。多數實驗室都配有基因直接測序的儀器，而對無直接測序儀器的實驗室而言，若要研究SNP，則需要找到一種高效、經濟的基因分型方法。

作為第3代遺傳標記的SNPs是基因組變異最常見的一種形式，大規模SNPs的鑒定和SNPs公共數據庫的建立大大促進了復雜性疾病相關基因研究的發展［4］。研究證實，SNPs與消化道腫瘤有密切的關系［5］。此外，對于GITRL與腫瘤關系的研究亦是熱點，考慮到GITRL與疾病有密切的關系［6］，本實驗室擬從GITRL基因組學的角度分析其與疾病間的關系，從而為疾病的鑒定及治療提供可能的依據［7］。

近幾年來，GITR及其配體GITRL在抗腫瘤免疫中的作用引起了學者的廣泛關注，尤其是通過調控GITR/GITRL系統作為一種治療腫瘤的新途徑的理念更是成為關注焦點。研究報道，GITRL基因SNP-rs2236876與過敏性哮喘有關［8］。本實驗室針對GITRL基因rs2236876A/G進行基因分型方法的比較，根據實驗室的情況，選擇了Taqman-MGB探針法、PCR-RFLP法、直接測序法進行基因分型比較。我們發現采用PCR-RFLP法進行基因分型費用低，但耗時較長，且步驟較為煩瑣；此外，雖然基因型能直接在瓊脂糖凝膠電泳中鑒別出來，但易受客觀因素（如PCR、電泳等）影響；Taqman-MGB法費用較高，但耗時很短，可在1 d之內檢測出500例樣本的SNP；直接測序法需要交由專業的公司測定，費用較高，耗時較長，得到結果后仍要做峰狀圖譜的分析，在本實驗中不適用。

因此，我們選擇了Taqman-MGB探針法作為GITRL基因rs2236876A/G基因分型的方法，將PCR-RFLP作為基因分型結果的驗證方法，另外將直接測序法作為有爭議的PCR-RFLP結果的確定方法。

［1］ 趙嘉慧，張華屏.外周血DNA提取方法的比較及改良［J］.山西醫科大學學報，2006，37（1）：12-13.

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［3］ Huang J，Gao C，Ding X，et al.MGB-based one-step multiplex real-time PCR method for rapid detection of HPV［J］.Cancer Biomark，2012，12（3）：107-113.

［4］ Baeten D，Van Damme N，Van den Bosch F，etal.Impaired Th1 cytokine production in spondyloarthropathy is restored by anti-TNFα［J］.Ann Rheum Dis，2001，60（8）：750-755.

［5］ Demontis D，Pertoldi C，Loeschcke V，et al.Efficiency of selection，asmeasured by single nucleotide polymorphism variation，is dependent on inbreeding rate in Drosophila melanogaster［J］.Mol Ecol，2009，18（22）：4551-4563.

［6］ Mosbruger TL，Duggal P，Goedert JJ，etal.Large-scale candidate gene analysis of spontaneous clearance of hepatitis C virus［J］.J Infect Dis，2010，201（9）：1371-1380.

［7］ Chattopadhyay K，Ramagopal UA，Mukhopadhaya A，et al.Assembly and structural properties of glucocorticoidinduced TNF receptor ligand：implications for function［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（49）：19452-19457.

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Com parison ofmethod for GITRL SNP-rs2236876 genotyping

WU Jing-jing，TONG Jia，CHEN Juan，YUAN Jing，TIAN Jie，TANG Xin-yi，WANG Sheng-jun
（Institute of Laboratory Medicine，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：Comparing three single nucleotide polymorphism（SNP）genotypingmethods，to choose an accurate and effective SNP genotypingmethod for rs2236876A/G of GITRL gene.M ethodsSNP genotyping for rs2236876A/G of GITRL were performed and compared by Taqman-MGB probe，the PCRRLFP and direct sequencing.Results：PCR-RLFP showed the genotyping result by electrophoresis，which was suitable for a small number of experimental subjects.Taqman-MGB probe showed the genotyping result by fluorescence，which was suitable for a large number of experimental subjects.Direct sequencingmethod was operated by the sequencing company which was expensive.Conclusion：For rs2236876A/G of GITRL gene，Taqman-MGB probemethod could be chosen for genotyping，PCR-RFLPmethod confirmed the genotyping results and，at the same time，the direct sequencing finally validated the result of PCR-RFLP.

Taqman-MGB probe；SNP genotyping；PCR-RFLP；GITRL

R393

A

1671-7783（2015）04-0308-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y130120

國家自然科學基金資助項目（81072453，31170849，30972748）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011472）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目（CXLX11_0608）；江蘇省衛生廳醫學科研基金資助項目（Z201313）；江蘇省“青藍工程”項目；江蘇大學“拔尖人才工程”和高級人才基金項目

吳晶晶（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：sjwjs@mail.ujs.edu.cn

2013-06-04 ［編輯］ 劉星星