逍遙散對慢性溫和不可預知應激誘導抑郁模型大鼠盲腸炎癥應答相關基因表達的影響

陳建麗，孫海峰，秦雪梅，田俊生

（山西大學1.中醫藥現代研究中心，2.化學化工學院，太原山西030006)

逍遙散對慢性溫和不可預知應激誘導抑郁模型大鼠盲腸炎癥應答相關基因表達的影響

陳建麗1，孫海峰2，秦雪梅1，田俊生1

（山西大學1.中醫藥現代研究中心，2.化學化工學院，太原山西030006)

目的探討逍遙散對慢性溫和不可預知應激（CUMS)誘導的抑郁大鼠盲腸炎癥應答相關基因表達的影響。方法采用孤養并結合10種刺激因子連續21 d復制CUMS模型，造模后恢復7 d，并且同時ig給予氟西汀6.0 mg·kg-1和逍遙散生藥46.2 g·kg-1，連續給藥28 d。分別于第0,21和28天進行體質量、糖水偏愛及曠場實驗檢測；第29天采集盲腸組織，計算盲腸指數；采用HE染色觀察盲腸組織病理變化；采用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR)檢測炎癥應答相關基因蛋白激活酶受體2（Par2)、Par4和Toll樣受體2（Tlr2)轉錄水平。結果與正常組相比，造模結束及恢復1周后，CUMS模型組大鼠體質量、糖水偏愛率、爬行格數、站立次數和理毛時間顯著降低（P＜0.05)；給予逍遙散生藥46.2 g·kg-1或氟西汀6.0 mg·kg-1可顯著改善上述抑郁行為。與正常對照組相比，CUMS模型組大鼠盲腸指數顯著增加28.6%，而逍遙散治療后顯著降低35.0%（P＜0.05)。HE染色結果顯示，CUMS模型組大鼠盲腸組織固有結構受損并出現水腫現象，而逍遙散治療后恢復了盲腸組織固有結構。RT-PCR結果顯示，與正常對照組相比，CUMS模型組炎癥應答相關的基因Par2，Par4和Tlr2轉錄水平分別上調138.0%，14.7%和14.5%，Par2具有顯著性差異（P＜0.01)；而逍遙散治療后分別回調了41.0%，37.9%和67.4%。結論CUMS激活了大鼠盲腸炎癥應答相關基因的表達，而逍遙散可通過降低大鼠盲腸Par2,Par4和Tlr2mRNA表達而發揮抗抑郁作用。

抑郁癥；逍遙散；盲腸；炎癥

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.004

抑郁癥是一種嚴重的精神疾病，在2030年將成為導致死亡的主要原因［1］。抑郁癥的發病機制與炎癥應答息息相關，Maes等[2]1999年提出了“炎癥免疫應答模型系統”，而且有研究發現炎癥因子的表達與抑郁癥的治療效果有關［3-4］。有人提出“腦腸軸”可能在抑郁癥發生及治療中有重要的作用［5-6］，腸道功能性疾病常伴隨著抑郁癥的發生，抑郁癥患者和模型動物腸道功能和菌群代謝異常［7-9］。然而關于抑郁癥和盲腸之間的關系少有關注。

本研究采用慢性溫和不可預知應激（chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠抑郁模型，給予經過本課題組篩選的逍遙散最佳抗抑郁劑量（生藥46.2 g·kg-1)［10］，取大鼠盲腸為研究對象，通過HE染色和逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)從組織形態學以及與炎癥應答相關基因即蛋白酶激活受體2（proteinase activated receptor 2，Par2)、Par4和Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，Tlr2)表達兩方面，探討抑郁癥大鼠是否發生盲腸炎癥反應及服用逍遙散后的變化，為闡明抑郁癥和腸道炎癥應答之間的關系及闡明逍遙散抗抑郁作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

氟西汀，批號：A342299，英國Eli Lilly＆Company Limited公司。中藥材飲片（北柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、甘草、生姜和薄荷)，購自山西華陽藥業有限公司，經山西大學中醫藥現代研究中心秦雪梅教授鑒定均為正品。Trizol試劑，美國Invitrogen公司。M-MuLV逆轉錄酶、隨機六合引物、RNase抑制劑、dNTP和rTaq DNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司。RNA酶和焦碳酸二乙酯（DEPC)，上海生工生物工程有限公司。

切片機和LEICA EG1150C組織包埋機（德國Leica公司)；PTC-1148型MJ MiniTM梯度溫度循環儀（美國Bio-Rad公司)；Gene Snap凝膠成像系統（美國Gene公司)。

1.2 逍遙散浸膏粉的制備

按照逍遙散組方比例（柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜按6∶6∶6∶6∶6∶3∶2∶2)稱取藥材，以1∶10（W∶V)加入蒸餾水浸泡2 h，水煎提取2 h，收集水煎液，再用8倍體積水提取2次，每次1 h。合并3次水煎液，減壓濃縮至稠浸膏后，干燥，磨成干粉。計算出膏率，4℃保存，使用時折算成生藥量進行配制。

1.3 動物、造模及分組給藥

24只成年雄性Sprague-Dawley（SD)大鼠，體質量160～200 g，購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心，許可證編號：SCXK（京)2011-0012。動物自然晝夜節律光照，適應1周后進行實驗。按Li等［11］的方法制備CUMS抑郁模型，即孤養并結合10種刺激因子：①潮濕墊料、45°傾斜；②禁食24 h；③禁水24 h；④50℃環境5 min；⑤夾尾1 min；⑥4℃冰水游泳5 min；⑦電擊：電壓50 mV，每隔30 s刺激1次，每次10 s，共15次；⑧束縛4 h；⑨接觸陌生物體（如塑料杯、木勺等)；⑩噪聲（60 Hz)1 h。每日1種刺激，同種刺激不連續出現，造模21 d，恢復7 d。

大鼠適應1周期間，進行曠場實驗、糖水偏愛實驗并稱量體質量。依據行為學結果和體質量，隨機分為4組：正常對照組、CUMS模型組、氟西汀6.0 mg·kg-1組和逍遙散生藥46.2 g·kg-1組，每組6只。除正常對照組外，其余各組造模同時ig給予相應的藥物生理鹽水溶液10 mL·kg-1，1次/d，連續給藥28 d，正常對照組及CUMS模型組ig給予等量的生理鹽水。分別于第0，21和28天測定各組大鼠體質量。

1.4 糖水偏愛實驗檢測糖水偏愛率

實驗前2 d進行1%糖水訓練實驗（先糖水喂養48 h，之后禁水24 h)，之后第0，21和28天對各組大鼠實施糖水偏愛實驗。每只大鼠準備糖水和自來水，以大鼠糖水偏愛率（糖水消耗量/總液體消耗量)作為評價指標。

1.5 曠場實驗測定爬行格數、站立次數、不動時間和理毛時間

第0，21和28天進行曠場實驗。將大鼠置于光潔敞箱（80 cm×80 cm×40 cm)正中央，敞箱底部分為16個等邊方格，觀察記錄大鼠5 min內爬行格數（穿越底部方格數，穿越1格為1分)、站立次數（兩前腿離地或攀爬箱壁)、不動時間和理毛時間。

1.6 盲腸組織樣本收集、盲腸指數測定和HE染色觀察病理改變

實驗第29天，腹腔注射烏拉坦（20%)麻醉，解剖盲腸，生理鹽低溫水洗滌，稱質量，計算各組大鼠的盲腸指數。盲腸指數=盲腸質量（g)/體質量（g)× 100。盲腸組織分成兩份，一份用生理鹽水沖洗，10%甲醛固定（用于組織形態觀察)，縱切成小塊，流水沖洗30 min，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。包埋好的石蠟塊進行切片，厚度為5 μm，并按照HE染色，顯微鏡下觀察。另一份用無RNA酶水沖洗，液氮速凍，-80℃保存，用于基因表達分析。

1.7 RT-PCR法檢測盲腸組織Par2，Par4和Tlr2mRNA表達

以Trizol法提取各組大鼠盲腸組織的總RNA，按反轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄成cDNA，并按PCR試劑盒操作說明進行擴增。Par-2，Par-4，Tlr-2和β肌動蛋白的引物見表1。RT-PCR反應條件為：94℃預變性5 min，94℃預變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，反應40個循環，72℃延伸10 min。擴增產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，Gene Snap凝膠成像系統照相保存。根據DL 5000 DNA分子標準物中1000 bp的DNA含量（約90 ng)和條帶豐度計算PCR產物的電泳條帶量，即目的基因表達量=（目的基因條帶吸光度值/1000 bp DNA分子標準物條帶吸光度值)× 90 ng。

Tab.1 Primers of reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR)

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 逍遙散對CUMS模型大鼠體質量的影響

實驗結果顯示，第21天和第28天正常對照組大鼠體質量分別為314±12和（316±12)g；CUMS模型組分別為262±10和（268±7)g，與正常對照組相比，分別減少16.6%和15.1%，具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05，圖1)。28 d內大鼠體質量增長緩慢，表明應激能降低動物體質量。與CUMS模型組相比，氟西汀6.0mg·kg-1組和逍遙散46.2g生藥·kg-1組大鼠第21天體質量分別增加19.2%和14.5%，第28天體質量分別增加11.6%和16.7%，均具有顯著性差異（P＜0.05)，提示逍遙散具有抗抑郁作用，與陽性對藥照氟西汀相比，逍遙散對于體質量的回調作用更為穩定持久。

Fig.1 Effect of Xiaoyao powder on body mass of chronic unpredictable mild stress（CUMS)exposed rats.The rats were subjected to separation and 10 stressors for 21 d to establish the CUMS model and recovered within 7 d.The rats were ig given fluoxetine 6.0 mg·kg-1or Xiaoyao powder 46.2 g·kg-1for 28 d.x±s,n=6.＊P＜0.05,＊＊P＜0.01,compared with normal control group;#P＜0.05,##P＜0.01,compared with CUMS model group.

2.2 逍遙散對CUMS模型大鼠糖水偏愛率的影響

表2結果顯示，應激前各組大鼠的糖水偏愛率基本一致，無顯著性差異。第21天和第28天，與正常對照組相比，CUMS模型組大鼠糖水偏愛率分別降低50.7%和47.4%，有顯著性差異（P＜0.05)，提示CUMS造成大鼠快感缺失。與CUMS模型組相比，氟西汀6.0 mg·kg-1組第21天和第28天糖水偏愛率分別升高55.1%和61.9%，逍遙散46.2 g生藥·kg-1組分別升高67.4%和87.3%，均具有顯著性差異（P＜0.05)，并且28 d后逍遙散組已基本恢復至正常水平，提示逍遙散可逆轉CUMS導致的大鼠糖水偏愛率的降低，表現出較好的抗抑郁作用。

Tab.2 Effect of Xiaoyao powder on sucrose preference in CUMS exposed rats

2.3 逍遙散對CUMS模型大鼠曠場行為的影響

曠場試驗結果顯示，與正常對照組相比，CUMS模型組大鼠不動時間僅在造模結束后第21天顯著升高，7 d后即恢復至正常水平（圖2C)。正常對照組大鼠第21天和第28天爬行格數分別為47±5次和56±10次、站立次數分別為6±1次和8±3次、理毛時間分別為45.64±9.74和（38.26±6.29)s；CUMS模型組大鼠第21天和第28天爬行格數分別為14±4和（22±6)次、站立次數分別為1±0和（2±1)次、理毛時間分別為（14.52±3.62)s和（17.17± 7.65)s，與正常對照組相比，第21天和第28天爬行格數分別降低70.2%和60.7%、站立次數分別降低83.3%和75.0%、理毛時間分別降低68.2%和55.1%，均具有顯著性差異（P＜0.05，圖2A，B，D)，表明應激造成動物的活動能力下降，呈現抑郁行為。與CUMS模型組大鼠相比，第28天氟西汀6.0 mg·kg-1組大鼠爬行格數分別升高、站立次數和理毛時間分別增加63.6%，150.0%和182.4%，逍遙散生藥46.2 g·kg-1組大鼠分別增加109.1%，175.0%和17.6%，除逍遙散組理毛時間外（圖2D)，均具有顯著性差異（P＜0.05，圖2A，B，D)，提示逍遙散表現為抗抑郁作用。

2.4 逍遙散對CUMS抑郁模型大鼠盲腸指數及組織表現的影響

盲腸指數結果（表3)顯示，與正常對照組相比，CUMS模型組盲腸指數顯著升高28.6%（P＜0.05)，提示應激對大鼠的盲腸造成了一定的影響。與CUMS模型組相比，氟西汀6.0 mg·kg-1組盲腸指數無顯著性變化，而逍遙散46.2 g生藥·kg-1組盲腸指數降低35.0%，差異具有顯著性（P＜0.05)，說明逍遙散對CUMS應激后盲腸具有調節作用，并且優于陽性藥氟西汀。

Fig.2 Effect of Xiaoyao powder on number of crawlings（A),number of standings（B),immobility time（C),and grooming time（D)in CUMS exposed rats. See Fig.1 for the treatment.compared with the normal control group;compared with CUMS model group.

Tab.3 Effect of Xiaoyao powder on caecum index of CUMS exposed rats

大鼠的盲腸組織切片結果（圖3)顯示，正常對照組（圖3A)大鼠盲腸黏膜形成的皺襞排列整齊均勻，無斷裂，腸腺、血管分布于固有層和黏膜下層內。CUMS模型組（圖3B)黏膜上皮形成的皺襞雜亂無章，且有斷裂；腸隱窩截面積變小，有輕微的水腫現象；黏膜肌層不清晰，厚度不均一；且黏膜下層的厚度和正常對照組相比明顯變薄。和CUMS模型組相比，氟西汀6.0 mg·kg-1組（圖3C)和逍遙散生藥46.2 g·kg-1組（圖3D)明顯改善了盲腸細胞的水腫現象。氟西汀給藥后恢復了大鼠盲腸黏膜的固有結構，但有中性粒細胞涌入腔內，表明在該組的大鼠盲腸內可能發生了炎癥反應；而逍遙散組恢復了盲腸的結構組織，且無任何異常出現，接近于正常對照組的組織。

Fig.3 Effect of Xiaoyao powder on histopathological changes in caecum in CUMS exposed rats.See Fig.1 for the treatment.A：normal control group；B：CUMS model group；C：CUMS+fluoxetine 6.0 mg·kg-1group；D：CUMS+ Xiaoyao powder 46.2 g·kg-1group.The arrows show oedema and neutrophils in caecum cavity.

2.5 逍遙散對CUMS模型大鼠盲腸組織Par2，Par4和Tlr2mRNA表達的影響

圖4結果顯示，與正常對照組相比，CUMS模型組大鼠盲腸Par2，Par4和Tlr2mRNA表達上調138.0%，14.7%和14.5%，其中Par2mRNA表達差異具有顯著性（P＜0.01)。與CUMS模型組相比，氟西汀6.0 mg·kg-1組大鼠盲腸Par2，Par4和Tlr2mRNA表達分別下調37.2%，44.3%和56.8%，逍遙散46.2 g生藥·kg-1組分別下調41.0%，37.9%和67.4%，其中Par2和Tlr2mRNA表達差異具有顯著性（P＜0.05)。

Fig.4 Effect of Xiaoyao powder on relative mRNA expression of proteinase activated receptor 2（Par2), Par4 and Toll-like receptor 2（Tlr2)in caecum of CUMS exposed rats detected by RT-PCR.See Fig.1 for treatment.The relative mRNA expression of target genes was expressed as target gene/β-actin.compared with normal control group，#P＜0.05,compared with CUMS model group.

3 討論

本研究發現，CUMS降低了動物食欲、情緒狀況，對幸福事件的反應能力，以及運動能力和探索行為，造成了動物快感缺失，呈現出一系列抑郁行為，這與之前的報道相一致［12］。并且該模型在應激結束1周后和應激結束當天的抑郁行為基本一致，提示該模型穩定可靠。逍遙散能顯著改善大鼠的這些抑郁癥狀，表現出良好的抗抑郁作用。其中在曠場實驗中，CUMS模型組大鼠造模結束7 d后基本恢復至正常水平，這可能是由于不動時間這一評價指標易受外界因素（噪音、光線等)影響造成差異，因此沒有利用該指標進行藥效學評價。

逍遙散可能是通過作用于盲腸組織發揮抗抑郁作用。逍遙散能顯著降低在模型組中升高的盲腸指數，并且其回調作用優于氟西汀，此外，逍遙散改善了模型組盲腸組織受損的部位。而氟西汀6.0 mg·kg-1組盲腸組織切片出現了炎癥反應，這可能與氟西汀激活機體胃腸道功能有關［13］。任麗娜等［14］發現，氟西汀導致腹瀉大鼠的結腸中iNOS，NF-κB蛋白和細胞炎性因子TNF-α，IL-6以及IL-1β水平顯著增加，提示氟西汀應用中，可能通過NF-κB信號通路導致炎性免疫反應的發生。然而，也有研究表明，氟西汀能夠顯著降低敗血性休克和過敏性哮喘動物血清中炎性反應［15］；炎性反應的發生能夠限制氟西汀的抗抑郁作用［16］。氟西汀與炎癥反應之間關系可能與機體部位有關，而氟西汀促進CUMS大鼠盲腸炎癥反應的機制有待于進一步深入研究。

CUMS及逍遙散對盲腸的影響和作用可能與盲腸作為免疫系統的組成部分有關。劉瑋等［17］發現，結腸黏膜低度炎癥可以使結腸Par2表達上調；Par4這一潛在的內源性止痛因子，在正常和炎癥條件下能夠調節傷害性疼痛［18］。本研究發現，CUMS模型組大鼠盲腸中Par2轉錄水平顯著上調，表明CUMS可能激活了大鼠盲腸炎癥反應，這一現象與之前的研究相佐證，即Par2激活后可釋放神經遞質P物質［19］，P物質含量的升高可能和抑郁癥的發生相關［20］，然而逍遙散生藥46.2 g·kg-1和氟西汀6.0 mg·kg-1均能顯著降低盲腸Par2mRNA水平，顯示出一定的抗炎作用；此外，雖無統計學意義，但本研究中發現CUMS模型組大鼠盲腸Par4mRNA水平有升高的趨勢，而有報道發現Par4在神經元中可直接作用于多巴胺D2受體，若破壞Par4/多巴胺D2受體的作用可直接導致抑郁行為的發生［21]，應激引起的抑郁行為可能和Par4在紋狀體中降低有關［22］，這不一致結果可能與盲腸作為消化器官有關，而逍遙散和氟西汀給藥后顯示出一定的下調作用。Tlr2受體在炎癥反應中表達量上調［23］，并且有文獻報道抑郁癥模型中神經元Tlr2表達上調［24］，這與本研究發現的CUMS模型組大鼠在盲腸中Tlr2mRNA水平有上調趨勢結果相一致，而逍遙散和氟西汀起到了下調作用。雖然本研究從盲腸指數、組織形態學和基因轉錄水平方面顯示, CUMS對大鼠盲腸造成了影響，這種影響可能與盲腸炎癥應答激活有關，而逍遙散能有效改善這種變化，提示逍遙散作用于盲腸是其抗抑郁機制之一。但是本研究存在一定不足。首先，本研究中設置每組大鼠6只，符合藥理學統計學要求，但是由于面對不同應激時大鼠的個體差異較大，因此，在進行基因轉錄水平測定時同一組有較大的差異，提示我們此后應增加動物數量。此外，本研究檢測到CUMS組大鼠盲腸組織中Pat2水平顯著上調，Par4和Tlr2也有上調的趨勢，表明CUMS刺激后大鼠盲腸發生了炎癥應答反應，但是從組織形態學中未觀察到MS組大鼠存在炎性反應，這可能是由于組織切片只有在出現疾病表現時才能出現異常表現，與分子生物學相比，結果具有一定的滯后性，這也反映了分子生物學在疾病監測中的敏感性，而與炎癥應答相關的Par2，Par4和Tlr2，本研究僅發現Par2存在顯著性差異，這提示仍需對CUMS及逍遙散干預后的盲腸組織發生炎癥反應這一結論進行驗證。

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Effect of Xiaoyao powder on caecum inflammatory response related genes expression in chronic unpredictable mild stress model rats

CHEN Jian-li1,SUN Hai-feng2,QIN Xue-mei1,TIAN Jun-sheng1
（1.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

OBJECTlVETo elucidate the effect of chronic unpredictable mild stress（CUMS)andXiaoyaopowder on caecum inflammatory response related genes expression.METHODSTo induce the CUMS model，the rats were subjected to separation and 10 different stressors for 21 d and recovered for 7 d.Xiaoyaopowder 46.2 g·kg-1and fluoxetine 6.0 mg·kg-1were administered orally for 28 d.Body mass measurement,sucrose preference test,and open field test were conducted to evaluate the changes in behavior on d 0,d 21 and d 28.The caecum samples were collected and the caecum index was calculated on d 29.Hematoxylin and eosin stain of different treated groups was used to evaluate the changes in caecum histology,and the reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR)was employed to evaluate the transcriptional levels in related inflammation response genes including proteinase activated receptor 2（Par2),Par4and Toll-like receptor 2（Tlr2).RESULTSThe body mass,sucrose preference,number of crawlings,number of standings and grooming time of CUMS rats were significantly decreased on d 21 and d 28（P＜0.05),while administration of fluoxetine andXiaoyaopowder reversed those depressive behaviors.Compared with normal control group,the rat caecum index of CUMS model group was increased by 28.6%,which could be significantly decreased byXiaoyaopowder（P＜0.05).HE stain showed that the injured inherent structure and edema of caecum appeared in CUMS model rats,and thatXiaoyaopowder could improve these symptoms.RT-PCR result showed the transcriptional levels ofPar2,Par4andTlr2in CUMS rat caecum were increased by 138.0%，14.7%and 14.5%respectively compared with normal control group,whileXiaoyaopowder reversed these changes.CONCLUSlONCUMS activates the rat caecum inflammatory response related genes expression whileXiaoyaopowder can decrease the levels ofPar2,Par4andTlr2mRNA expression and have an antidepressant effect.

depression；Xiaoyaopowder；caecum；inflammation

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173366);National Natural Science Foundation of China（81102833);National Natural Science Foundation of China（81441096);and Basic Research Project of Shanxi Province（2012021031-2)

TIAN Jun-sheng,E-mail:jstian＠sxu.edu.cn,Tel：（0351)7019297

A

1000-3002（2015)04-0552-07

2014-10-16接受日期:2015-03-19)

（本文編輯:喬虹)

國家自然科學基金資助項目（81173366)；國家自然科學基金資助項目（81102833)；國家自然科學基金資助項目（81441096)；山西省基礎研究項目（2012021031-2)

陳建麗，女，碩士研究生，主要從事中藥神經藥理研究，E-mail：wonderfulfuture@163.com，Tel：（0351) 7019297；田俊生，男，博士，副教授，主要從事中藥神經精神藥理與新藥研發。

田俊生，E-mail:jstian@sxu.edu.cn，Tel：（0351)7019297