蛇床子素延緩叔丁基過氧化氫誘導的神經干細胞衰老

姚瓔珈，孔亮，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫藥大學1.研究生學院，2.藥理學教研室，遼寧大連116600）

蛇床子素延緩叔丁基過氧化氫誘導的神經干細胞衰老

姚瓔珈1，孔亮1，教亞男1，李少恒1，陶震宇1，閆宇輝1，楊靜嫻2

（遼寧中醫藥大學1.研究生學院，2.藥理學教研室，遼寧大連116600）

目的通過建立神經干細胞（NSC）體外衰老模型，探討蛇床子素（Ost）延緩NSC衰老的作用，并探討其可能調控機制。方法體外培養NSC，在增殖培養基中傳代純化培養至第3代，用于細胞實驗。利用叔丁基過氧化氫（t-BHP）50，100和150 μmol·L-1分別與NSC孵育1，2和3 h，CCK-8法檢測細胞存活率，確定t-BHP 100 μmol·L-1與NSC孵育2 h為制備細胞衰老模型的最佳條件。再加入Ost 50，100和150 μmol·L-1作用1，2和3 h，CCK-8法檢測細胞存活率，選擇Ost促進細胞存活的最佳作用濃度和作用時間。實驗分為細胞對照組、衰老模型組（NSC與t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h）和模型+Ost組（NSC與t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h后，再與Ost 100 μmol·L-1作用2 h），用Ki67染色法檢測NSC細胞增殖能力，免疫組化法檢測NSC分化能力，衰老β-半乳糖苷酶（Sa-β-gal）法檢測衰老細胞百分率，RT-PCR法檢測p53，p21，p19和p16基因表達，Western蛋白印跡法檢測P16、細胞周期蛋白依賴性激酶D1（CDKD1）和磷酸化成視網膜細胞瘤蛋白（pRb）蛋白表達。結果Ost 100 μmol·L-1作用2 h可明顯促進NSC存活（P＜0.01）。與細胞對照組相比，模型組NSC增殖能力明顯下降（P＜0.05），分化為星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞的能力亦明顯下降（P＜0.05），Sa-β-gal陽性衰老細胞百分率升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+Ost 100 μmol·L-1組NSC增殖能力升高（P＜0.05），分化為星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞的能力亦明顯提高（P＜0.05），Sa-β-gal陽性衰老細胞百分率下降（P＜0.01）。RT-PCR結果顯示，與模型組相比，模型+Ost 100 μmol·L-1組p16和p53mRNA表達水平降低（P＜0.05），p19和p21mRNA表達無顯著性變化；與模型組相比，模型+Ost 100 μmol·L-1組P16蛋白表達降低，同時CDKD1和pRb蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。結論Ost具有延緩t-BHP造成NSC衰老的作用，其延緩NSC衰老作用機制可能與調控P16-pRb信號通路有關。

神經干細胞；蛇床子素；增殖；分化；衰老

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.006

細胞衰老的概念是由Hayflick和Moorhead在培養正常人成纖維細胞時提出的，他們發現細胞能夠進入不可逆轉的生長停滯期［1］。人們對衰老機制的認識存在許多假說，例如免疫功能退化學說、自由基學說和線粒體損傷學說等［2］。隨著研究的深入，干細胞衰老是迄今解釋機體衰老機制的最新學說，人們意識到干細胞并非為“長生不老”的細胞。干細胞衰老表現為增殖能力和分化能力下降、端粒酶活性增強、端粒縮短以及與衰老相關基因和蛋白的表達上調［3］。神經干細胞（neural stem cells， NSC）的衰老表現為自我更新和多向分化能力衰退、對神經保護作用下降以及p16INK4a等衰老基因的表達上調［4］等。

蛇床子素（osthole，Ost）為獨活活性單體成分，中藥獨活為傘形科植物重齒毛當歸（Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan）的干燥根［5］，始載于《神農本草經》，具有祛風除濕、通痹止痛之功。現代藥理學研究發現，Ost具有治療肺炎［6］、改善腎缺血再灌注損傷［7］以及促進新生大鼠成骨細胞增殖［8］等作用。本研究通過建立NSC衰老模型，研究Ost是否具有延緩NSC衰老作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

自然分娩48 h內的乳小鼠（SPF級昆明種小鼠），體質量2～3 g，購自大連醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（遼）2008-0002。Ost，中國食品藥品檢定研究院。DMEM/F12培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶（0.25%）和雙抗（100 kU·L-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素），美國Gibco公司；cAMP、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），美國Peptide公司；Trizol試劑、B27添加劑（B27）和引物序列，美國Invitrogen公司；p16：（上）ATGATGGGCAACGTTCACGTA；（下）AACGCAAATATCGCACGATGT；p19：（上）TCCAAGATGCCTCCGGTACT；（下）CCTGTGGTGGAGATCAGATTCA；p21：（上）GGGACAAGAGGCCCAGTACTT；（下）TGCGCTTGGAGTGATAGAAATC；p53（上）GCCATGGCCATCTACAAGAAG；（下）GCCTCGGGTGGCTCATAAG；β肌動蛋白：（上）GGGAAATCGTGCGTGACAT；（下）TCAGGAGGAGCAATGATCTTG；DMSO，美國Sigma公司；CCK-8試劑盒，美國Dojindo公司；叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP），成都格雷西亞化學技術有限公司；大鼠抗巢蛋白（nestin）抗體和兔抗胚胎干細胞關鍵蛋白（SRY-related HMG-box 2，SOX2）抗體，美國Millipore公司；FITC標記山羊抗大鼠IgG抗體和Cy3標記驢抗兔IgG抗體，美國Jackson公司；兔抗Ki67抗體、兔抗膠質原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、兔抗少突膠質細胞前體蛋白（oligodendrocyte 2，NG2）抗體、兔抗神經元核（neuronal nuclei，NeuN）抗體、P16抗體、細胞周期蛋白依賴性激酶D1（cyclin-dependent kinases D1，CDKD1）抗體和磷酸化成視網膜細胞瘤蛋白（phosphorylation retinoblastoma protein，pRb）抗體，北京博奧森公司；第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR引物擴增試劑盒，美國Thermo公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence β-galactosidase，Sa-β-gal）染色試劑盒，碧云天公司；全蛋白提取試劑盒、Bradford法檢測蛋白濃度試劑盒和蛋白緩沖液上樣試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司；DEPC和Triton X-100試劑，美國Amresco公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA），北京索萊寶科技有限公司。24孔板培養板和EP管，美國Cyagen公司；倒置熒光生物顯微鏡，日本尼康公司；超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；CO2培養箱（NU-4750E），美國Nuaire公司；紫外-可見光分光光度計（UV-5600）和酶標儀（MR-96A），深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；PCR儀（MG96G），杭州朗基科學儀器有限公司；凝膠成像儀（4100），上海天能科技有限公司；水平核酸電泳儀（PowerPac系列），美國Bio-Rad公司。

1.2 NSC培養和鑒定

將自然分娩48 h內的小鼠浸泡在75%乙醇中10 min，將其固定在手術臺上，取出海馬區，用含雙抗的PBS液清洗，收集于EP管內，用手術剪將其剪碎，434.7×g離心8 min。棄上清，加入胰酶，37℃消化15 min，加入培養基終止消化，434.7×g離心8 min。棄上清，加入增殖完全培養基（DMEM/ F12+2%B27+0.2 μg·L-1EGF+0.2 μg·L-1bFGF+ 1%雙抗），混懸細胞，434.7×g離心7 min。棄上清，加入增殖培養基，以1×109L-1的密度接種于24孔板，5%CO2，37℃培養箱中培養［9］。培養3～4 d進行細胞傳代，培養純化至第3代NSC接種于96孔板，培養至第3天用于實驗。

以5×108L-1密度接種于96孔板，24 h后觀察細胞貼壁，用于鑒定。向96孔板每孔加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min，加入1%Triton X-100透化，PBS清洗3次，加入1%BSA稀釋的巢蛋白抗體和SOX2抗體（1∶150），4℃孵育過夜。次晨用PBS清洗細胞，分別加入FITC標記羊抗大鼠IgG和Cy3標記驢抗兔IgG二抗（1∶100），室溫孵育1 h，再用DAPI染核15 min，PBS清洗后吸凈培養孔內的液體，滴加少量抗熒光淬滅劑，在倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況，觀察巢蛋白、SOX2和DAPI陽性細胞，重復拍照3次。

1.3 NSC衰老模型的制備［10］

第3代NSC以5×109L-1密度接種于96孔板,培養24 h，將t-BHP溶于完全培養基，t-BHP終濃度分別為50，100和150 μmol·L-1，分別培養1，2和3 h。根據CCK-8試劑盒的說明書，每孔加入10 μL CCK-8溶液后放入培養箱內再培養4 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值（A），每組3復孔。細胞存活率（%）=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

1.4 CCK-8法檢測NSC存活率

選擇t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h制備NSC衰老模型，隨后再加入Ost 50，100和150 μmol·L-1作用1，2和3 h，細胞密度同1.3，用CCK-8試劑盒檢測細胞存活率，選擇Ost對NSC存活有促進作用的最佳濃度和作用時間。

1.5 Sa-β-gal法檢測NSC衰老陽性率

第3代NSC以5×109L-1密度接種于96孔板中培養24 h，先用t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h（同時設正常對照組和t-BHP模型組），然后每孔加入β-gal固定液100 μL，室溫15 min后用PBS清洗，每孔再加入100 μL染色工作液37℃孵育過夜，第2天吸出液體置于載玻片上觀察染色情況，觀察到部分NSC被染成藍色。每組設3復孔。在光鏡下計數NSC，再計數藍色NSC，藍色NSC數量占NSC總數百分比表示NSC衰老陽性率［11］。

1.6 免疫熒光染色法檢測NSC增殖和分化能力

根據1.5分組的細胞，第3代NSC以5×109L-1密度接種于96孔板中培養24 h，用t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h，洗去原培養液，換成不含t-BHP和Ost的培養基進行培養，第3天觀察NSC的神經球成球率。將NSC用兔抗Ki67一抗孵育過夜，再用Cy3標記驢抗兔IgG二抗孵育后，用DAPI染核15 min，計數Ki67染色陽性NSC百分率，檢測NSC增殖能力［12］。

將第3代細胞接種于分化培養基中（DMEM/F12+ 10%FBS+cAMP 100 mg·L-1+1%雙抗）［13］，用t-BHP100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h后洗去培養液，換成分化培養基再繼續培養至第7天，觀察各組NSC分化為不同類型的神經細胞。NSC分別用兔抗GFAP一抗、兔抗NG2一抗和兔抗NeuN一抗孵育過夜，再分別用Cy3標記驢抗兔IgG二抗孵育1 h，DAPI染核15 min。GFAP陽性細胞為星形膠質細胞，NG2陽性細胞為少突膠質細胞，NeuN陽性細胞為神經元。

1.7 RT-PCR檢測p53，p21，p19和p16基因的表達

取1.5分組并處理的細胞，將培養的神經球打散為單個NSC，培養于6孔板內，棄去培養液，提取細胞總RNA［14］。根據試劑盒的說明書合成cDNA，然后進行PCR擴增。擴增條件：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，p16，p19，p21，p53和β肌動蛋白退火溫度分別為61.9，65.3，64.4，65.8和53.3℃，30 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后延伸10 min。利用ImageJ圖像分析軟件對條帶進行積分吸光度（integrated absorbance,IA）掃描，用待測基因與β肌動蛋白條帶IA比值表示待測基因相對表達水平。

1.8 Western蛋白印跡法檢測P16，CDKD1和pRb蛋白表達

取1.5分組并處理的細胞，每組1×107細胞，根據全蛋白試劑盒說明書提取蛋白，用Bradford法檢測蛋白質濃度，配制SDS-PAGE凝膠，每孔加蛋白100 ng，80 V穩壓電泳。在樣品過濃縮膠后，調整為100 V，當指示劑達到分離膠底部停止電泳，然后用預飽和的PVDF膜進行轉膜，將PVDF膜用TBST液清洗后，用1∶1000稀釋的抗P16，CDKD1,pRb和β肌動蛋白一抗孵育，4℃過夜，次晨用1∶2000稀釋的二抗37℃孵育1 h，用DAB試劑盒顯色，用ImageJ圖像分析軟件對條帶進行IA掃描，用待測蛋白與β肌動蛋白條帶IA比值表示待測蛋白相對表達水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 NSC培養與鑒定

培養至第3天細胞完全形成NSC球并逐漸增大，第5天形成由大量單個細胞組成近圓形的NSC球（圖1A）。巢蛋白免疫熒光染色單個NSC核為綠色（圖1B），SOX2為紅色（圖1C），巢蛋白和SOX2重復（merge）結果（圖1D和E）顯示，通過機械分離培養的NSC球同時顯示巢蛋白和SOX2陽性特征。免疫熒光檢測結果顯示，巢蛋白特異性標志NSC陽性細胞數占DAPI標記的細胞核陽性細胞數的比例＞95%，表明培養純化至第3代的細胞基本為NSC。

Fig.1 ldentification of neural stem cells（NSCs）from rat hippocampus by immunofluorescent staining.A：Typical neurosphere on the 5th day（×400）；B：nestin stained NSCs（×400）；C：SRY-related HMG-box 2（SOX2）stained NSCs（×400）；D：nestin/SOX2merge photo（×400）；E：nestin/SOX2merge photo（×200）.

2.2 NSC衰老模型的制備條件

CCK-8法檢測結果（圖2）表明，t-BHP 50 μmol·L-1作用1～3 h對NSC存活無明顯抑制作用；150 μmol·L-1作用2和3 h，＞60%細胞死亡；t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h NSC存活率為（61.3± 3.6）%。因此，選擇t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h制備NSC衰老模型。

Fig.2 Survival rate of NSCs with tert-butyl hydroperoxide（t-BHP）treatment.compared with t-BHP 1 h group at the same concentration.

2.3 蛇床子素對衰老NSC存活率的影響

由圖3可見，t-BHP 100 μmol·L-1作用1～3 h, NSC存活率均明顯低于正常對照組（P＜0.01）；Ost 100和150 μmol·L-1作用2 h對t-BHP導致的NSC存活率下降有改善作用（P＜0.01，P＜0.05）。Ost其他濃度和其他作用時間無明顯作用。

Fig.3 Effect of osthole（Ost）on NSC survival after treatment with t-BHP.compared with normal control group on the same time；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with t-BHP group on the same time.

2.4 蛇床子素對NSC衰老率的影響

由圖4所示，與正常對照組相比，模型組Sa-βgal染色陽性細胞百分率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，Ost 100 μmol·L-1作用2 h Sa-β-gal染色陽性細胞百分率下降30.0%（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of Ost on percent of senescence β-galactosidase（Sa-β-gal）stainingpositiveNSCsafter treatment with t-BHP（×200）.NSCs were incubated with t-BHP 100 μmol·L-1for 2 h，then incubated with Ost 100 μmol·L-1for another 2 h.A：normal control；B：t-BHP group；C：t-BHP+Ost group.The arrow shows senescenced NSCs.D was the quantitative result of A-C.n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with t-BHP group.

2.5 蛇床子素對NSC增殖和分化的影響

由圖5所示，與正常對照組相比，模型組ki67陽性NSC百分率明顯降低（P＜0.01），Ost組ki67陽性率與模型組相比增加了43.9%，表明Ost可逆轉t-BHP導致的NSC增殖能力的降低。

Fig.5 Effect of Ost on proliferation of NSCs after treatment with t-BHP（×200）.See Fig.4 for the cell treatment.A:normal control group;B:t-BHP model group;C:t-BHP+ Ost group;1:Ki67 staining cells(red);2:DAPI staining cells (blue);3:Ki67+/DAPI+merge diagram.D was the quantitative result of A-C.compared with normal control group;##P＜0.01,compared with t-BHP group.

由圖6所示，與正常對照組相比，NSC分化為星形膠質細胞（GFAP，紅色）、神經元（NeuN，紅色）和少突膠質細胞（NG2，紅色）NSC百分率明顯降低（P＜0.05,P＜0.01）；與模型組相比，Ost組NSC分化為星形膠質細胞和神經元的百分率分別提高了29.4%和17.8%，但分化為少突膠質細胞的百分率無顯著性變化。

2.6 蛇床子素對P53-P21-PRb與P16-PRb通路上的p53，p21，p19和p16mRNA表達的影響

由圖7所示，與正常對照組相比，模型組p16，p19，p21和p53mRNA的表達明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，Ost組p16和p53mRNA的表達分別降低至44.7%和38.5%（P＜0.05），但p21和p19mRNA的表達無顯著性差異，提示Ost可能對NSC的P16-pRb信號通路有影響。

2.7 蛇床子素對NSCP16-pRb通路上的P16，CDKD1和pRb蛋白表達的影響

Fig.6 Effect of Ost on differentiation ability of NSCs after treatment with t-BHP（×200）.See Fig.4 for the cell treatment.A:normal control group;B:t-BHP model group;C: t-BHP+Ost group;1:GFAP+（red）/DAPI+(blue)merge diagram; 2:NeuN+（red）/DAPI+（blue）merge diagram;3:NG2+（red）/ DAPI+(blue)merge diagram.D was the quantitative result ofcompared with normal control group;#P＜0.05,compared with t-BHP group.

Fig.7 Effect of Ost on p53，p21，p19 and p16 mRNA expression of NSCs after treatment with t-BHP by RT-PCR. See Fig.4 for the cell treatment.Lane 1：normal control group；lane 2：t-BHP model group；lane 3：t-BHP+Ost group.B was the semiquantitative result of A.compared with normal control group；#P＜0.05，compared with t-BHP group.

由圖8所示，與正常對照組相比，模型組P16蛋白表達升高了49.1%，CDKD1和pRb蛋白表達分別下降了48.8%和35.1%（P＜0.05，P＜0.01）；Ost組與模型組相比，P16蛋白表達降低了20.7%，CDKD1和pRb蛋白表達提高了16.9%和16.6%（P＜0.01），進一步表明Ost延緩NSC衰老的作用機制可能是與P16-pRb通路有關。

Fig.8 Effect of Ost on protein expression of P16, cyclin-dependent kinases D1(CDKD1）and phosphorylation retinoblastoma protein(pRb）in NSCs after treatment with t-BHP by Western blotting.See Fig.4 for the cell treatment.Lane 1:normal control group;lane 2:t-BHP model group;lane 3:t-BHP+Ost group.B was the semiquantitative result of A.compared with normal control group;#P＜0.05,compared with t-BHP group.

3 討論

NSC是一種具有自我更新、多向分化的細胞，t-BHP為一種過氧化物，它可通過氧化應激途徑造成細胞的增殖能力、分化能力下降而衰老。本研究發現，t-BHP造模后，NSC的增殖和分化能力均明顯下降，符合NSC衰老特征。Ost 100 μmol·L-1作用2 h后，與衰老模型組相比，可明顯提高NCS存活率；通過免疫熒光染色法發現，Ki67陽性率增加了43.9%，向星形膠質細胞和神經元分化能力提高了29.4%和17.8%，向少突膠質細胞細胞分化不明顯。另外，Ost作用后，可降低與衰老相關的β-gal陽性率。上述結果表明，Ost可改善衰老NSC的增殖和分化能力，并降低衰老細胞的百分率，對NSC具有延緩衰老的作用。

P53-P21-pRb和P16-pRb信號途徑是誘導細胞衰老的兩條途徑。p16基因是由Serrano等［15］利用酵母雙雜交蛋白互相作用掃描技術發現的一個陽性cDNA克隆蛋白，此蛋白對CDK4活性具有抑制作用，所以將其稱為P16INK4a。pRb為人成視網膜瘤細胞，當細胞出現衰老狀態，P16使CDKD1活性下降，進而會抑制pRb的磷酸化，使其處在低磷酸化狀態［16］。本研究發現，NSC用t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h，可明顯降低p16mRNA的表達，p21和p19 mRNA表達與模型組相比無顯著性差異。提示Ost有可能通過作用于P16-pRb途徑發揮延緩NSC衰老的作用。Western蛋白印跡法結果表明，Ost可明顯降低NSC P16蛋白表達，增強CDKD1和pRb蛋白表達。說明，Ost對體外培養的NSC具有延緩衰老的作用，并且可能通過P16-pRb途徑發揮其作用。

大多數神經退行性疾病與氧化損傷引起的神經元丟失有密切關系［17］，例如阿爾茨海默病，公認的致病學說為神經元的丟失，因為隨著年齡的增加，NSC出現衰老現象，增殖和分化能力均下降，最終導致疾病的發生。本研究通過Ost作用于衰老NSC，增強其增殖和分化能力，并且分化為更多神經元，這將為治療有關神經元丟失的疾病提供新的治療途徑。但從遺傳因素來看，衰老并非由單一基因所決定，而是由一套成熟的途徑中的各種靶點刺激下游基因發生上調或者下調而引起的，本課題組正結合中藥多靶點的作用特點，對發揮延緩NSC衰老的作用進行進一步研究。

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Osthole delays neural stem cells senescence induced by tert-butylhydroperoxide

YAO Ying-jia1，KONG Liang1，JIAO Ya-nan1，LI Shao-heng1，TAO Zhen-yu1，YAN Yu-hui1，YANG Jing-xian2
（1.Graduate School,2.Department of Pharmacology,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

OBJECTlVETo investigate the effect of osthole（Ost）on retardation of neural stem cells（NSCs）senescence induced by tert-butyl hydroperoxide（t-BHP）and to study the related mechanismin vitro.METHODSNSCs were cultured until the 3rd generation in proliferation mediumin vitroand used for subsequent experiments.t-BHP 50，100 and 150 μmol·L-1was incubated with NSCs for 1，2 and 3 h，and the viability of NSCs was determined using CCK-8 assay.Then,Ost 50，100 and 150 μmol·L-1was added for 1，2 and 3 h to choose the suitable concentration of Ost used in the following experiments.The ability of proliferation of NSCs was tested by Ki67 staining and differentiation by immune staining.Assay for aging cells was measured by senescence β-galactosidas（Sa-β-gal）stainingkit.Then,the mRNA expression ofp53，p21，p19andp16gene was detected by RT-PCR，and the expression of P16，cyclinD1 and pRb proteins was detemined by Western blotting.RESULTSThe CCK-8 assay results showed the optimum condition of t-BHP for the NSCs aging model was 100 μmol·L-1for 2 h，and the survival rate with Ost treatment increased significantly（P＜0.01）.The Ki67 positive rate significantly decreased（P＜0.05），the ability of proliferation into astrocytes，neurons and oligodendrocytes also decreased（P＜0.05），but Sa-β-gal staining revealed that percentage of aging NSCs increased（P＜0.01）in model group compared with control group.The Ki67 positive rate significantly increased（P＜0.05），the ability of proliferation into astrocytes，neurons and oligodendrocytes also increased（P＜0.05）,and Sa-β-gal staining revealed the decreasing percentage of aging NSCs（P＜0.01）in Ost group compared with model group.The results of RT-PCR showed that the expression ofp16andp53mRNA levels decreased in Ost group compared with t-BHP group（P＜0.05）.The expression ofp19andp21mRNA was not significantly different between model group and Ost group. The results of Western boltting showed that the expression of P16 protein decreased，while cyclinD1 and pRb protein increased in Ost group，respectively，compared with modelgroup（P＜0.05）.CONCLUSIONOst may delay the aging of NSCs induced by t-BHP,which may be related to inhibition of the activation of P16-pRb signaling pathway.

neural stem cells；osthole；proliferation；differentiation；senescence

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173580）;National Natural Science Foundation of International Cooperation and Exchange Projects（81210108050）;and Liaoning Province Higher Talents to Support Projects（5 group,No.191）

YANG Jing-xian,E-mail:1980483684＠qq.com

R285.5

A

1000-3002（2015）04-0565-08

2014-12-04接受日期：2015-07-21）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（81173580）；國家自然科學基金國際合作交流項目（81210108050）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目（5組191號）

姚瓔珈（1990-），女，碩士研究生，主要從事神經藥理學研究。

楊靜嫻，E-mail：1980483684＠qq.com