胃癌耐藥細胞株SGC7901/阿霉素中miR-185的表達及對細胞多藥耐藥性的影響

李 勇，檀碧波，范立僑，趙 群，王 冬，劉 羽，劉慶偉

胃癌發病率近年有所下降，但仍居消化道惡性腫瘤首位。化療是胃癌綜合治療的主要措施之一，而較強的多藥耐藥性(MDR)常造成胃癌化療失敗，患者預后較差［1-2］。胃癌MDR的發生機制和逆轉研究是目前研究的熱點，但尚未取得重要進展。近期microRNA在惡性腫瘤中的作用已成為腫瘤發病機制及治療的研究熱點，有研究發現某些microRNA在胃癌MDR中發揮作用，也有研究顯示microRNA-185(miR-185)與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及MDR有關［3-5］，但miR-185與胃癌MDR關系的相關研究報道較少。本研究檢測了胃癌細胞株SGC7901和耐阿霉素 (ADR)的細胞株SGC7901/ADR中miR-185表達情況，并應用 miR-185模擬物轉染SGC7901/ADR，初步探討了miR-185參與胃癌MDR的作用機制。

1 材料與方法

1.1 病理資料 選取2014年3—5月于河北醫科大學第四醫院行胃癌切除術的20例患者胃癌及癌旁組織標本。患者男14例，女6例;年齡36～73歲，平均年齡 (56.6±9.0)歲;術前均經胃內鏡病理活檢確診。患者術后TNM分期為ⅡB～ⅢC期，均為中高分化腺癌。患者術前均未接受放化療等治療。術中腫瘤切除后取胃癌組織和癌旁組織 (距離腫瘤邊緣大于3 cm，術后病理證實無癌細胞存在)各1份，1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，置于液氮中保存，盡快轉入-80℃深低溫冰箱，用于后續實驗。本研究經本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及試劑 人胃腺癌細胞株SGC7901由本院科研中心保種，正常胃上皮細胞株GES-1購自中國科學院上海細胞研究所，細胞株SGC7901/ADR由第四軍醫大學消化病研究所樊代明院士惠贈。RPMI 1640培養液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;Trizol試劑、脂質體購自美國Invitrogen公司;反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑購自美國Promega公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;miR-185模擬物購自美國AB公司;miR-185熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國GeneCopia公司;蛋白提取試劑盒購自美國Bio-rad公司;MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP及 GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司;MTT試劑購自美國Sigma公司;ADR購自浙江海正藥業股份有限公司，10 mg/支;5-氟尿嘧啶 (5-FU)購自西安海欣制藥有限公司，250 mg/支;草酸鉑 (LOHP)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，50 mg/支。

1.3 細胞培養 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中培養，2～3 d傳代1次。取對數生長期的細胞經消化分散后計數，制成細胞懸液備用。SGC7901/ADR細胞在含有0.4 mg/L的ADR中培養以維持其耐藥表型。

1.4 miR-185模擬物合成及轉染 細胞株SGC7901/ADR以密度為4×105個/ml接種于6孔板，置入37℃、95%濕度、5%CO2培養箱內常規培養24 h。轉染前用無血清無抗生素的RPMI 1640培養液清洗細胞，用RPMI 1640培養液稀釋的miR-185模擬物或無關對照序列以及轉染試劑脂質體，混合靜置后轉染SGC7901/ADR細胞。轉染24 h后，取轉染效率＞90%的細胞株進行后續實驗。

1.5 細胞株SGC7901/ADR體外藥敏試驗 分別將ADR、5-FU、L-OHP加入經miR-185模擬物或無關對照序列轉染及未轉染的細胞株SGC7901/ADR各6個復孔，置入37℃、95%濕度、5%CO2培養箱內培養24 h。

于培養結束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl。培養結束后，棄去培養液，各孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩15 min，采用酶標儀于波長490 nm處測定吸光度值 (OD值)。以上實驗重復3次。計算各藥物對細胞株SGC7901/ADR的抑制率，抑制率=(對照OD值-待測OD值)/對照OD值，其中對照OD值由未加入藥物的細胞株SGC7901/ADR同步培養測定。

1.6 細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因mRNA及各細胞株miR-185表達 采用Trizol一步法提取總RNA，取2 μg反轉錄合成 cDNA。取 2 μl反轉錄產物、10 μl SYBR Green Mix、多藥耐藥基因上下游引物各0.5 μl，按試劑盒說明建立終體積為20 μl的PCR體系。PCR熱循環參數為:95℃ 5 min，94℃30 s，60℃ 30 s，進行45個循環。應用Primer 5.0設計多藥耐藥基因引物序列:MDR1/P-gp(F):5'-GTGGGGCAAGTCAGTTCATT-3'， (R):5'-TCTTCACCTCCAGGCTCAGT-3';MRP-1(F):5'-GGGGTCCTCATTATCTTCTGG-3'， (R):5'-TGGTCTCAGGGTAGGGGTTAG-3';GST-π(F):5'-GGAGACCTCACCCTGTACCA-3'， (R):5'-GGCTAGGACCTCATGGATCA -3';LRP (F):5'-ACCAACCCTGACGACAGAAG-3'， (R):5'-CATGTCTCCCGATCTCTGGT-3'。內參基因GAPDH(F):5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'， (R):5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。采 用 2-ΔΔCt法 計 算 各 基 因mRNA的相對表達水平。各細胞株miR-185表達同樣采用上述熒光定量PCR測定，嚴格按microRNA檢測試劑盒說明進行。

1.7 細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥蛋白表達 采用Western blotting法測定多藥耐藥蛋白相對表達水平。對轉染細胞株SGC7901/ADR培養24 h后提取總蛋白，進行蛋白定量后，取60 μg于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜，置入TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用稀釋后的多藥耐藥蛋白一抗或內參一抗4℃孵育過夜，經TBST漂洗3次后，加相應辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1 h，化學發光法顯色，對條帶進行積分吸光度掃描，計算多藥耐藥蛋白相對表達水平。

1.8 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-185相對表達水平比較 癌旁組織和胃癌組織miR-185相對表達水平分別為 (0.910±0.142)、 (0.243±0.045)，差異有統計學意義 (t=20.025，P＜0.001)。細胞株GES-1、SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相對表達水平分別為 (0.903 ± 0.117)、 (0.630 ± 0.101)和 (0.191±0.030)，差異有統計學意義 (F=46.850，P＜0.001)。其中，細胞株SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相對表達水平低于GES-1，細胞株SGC7901/ADR miR-185相對表達水平低于 SGC7901(P＜0.05)。

2.2 各藥物對不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR的抑制率 ADR、5-FU和L-OHP對不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR抑制率比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。其中，ADR、5-FU和L-OHP對miR-185模擬物轉染的細胞株SGC7901/ADR抑制率高于未轉染和無關對照序列轉染 (P＜0.05，見表1)。

2.3 細胞株SGC7901/ADR經轉染后多藥耐藥基因mRNA相對表達水平 經不同轉染處理后，細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因LRP mRNA相對表達水平比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。經不同轉染處理后，細胞株SGC7901/ADR多耐藥基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA相對表達水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.05)。其中，miR-185模擬物轉染的細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA相對表達水平低于未轉染和無關對照序列轉染 (P＜0.05，見表2)。

表1 各藥物對不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR抑制率的比較(±s，%，n=3)Table 1 Comparison of inhibition rate of drugs on cell SGC7901/ADR by different transfected

表1 各藥物對不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR抑制率的比較(±s，%，n=3)Table 1 Comparison of inhibition rate of drugs on cell SGC7901/ADR by different transfected

注:與未轉染比較，*P＜0.05;與無關對照序列轉染比較，△P＜0.05;ADR=阿霉素，5-FU=5-氟尿嘧啶，L-OHP=草酸鉑

處理因素37.2 ±5.7 40.9 ±6.0 36.6 ±4.4無關對照序列轉染 38.9±5.0 42.7 ±5.3 38.3±5.0 miR-185模擬物轉染 74.7±9.7＊△ 81.7±5.4＊△ 69.5±7.2＊△F ADR 5-FU L-OHP未轉染0.001 ＜0.001 ＜0.001 26.800 50.640 31.770 P值值

表2 不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因mRNA相對表達水平的比較 (±s)Table 2 Comparison of multidrug resistance gene mRNA relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

表2 不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因mRNA相對表達水平的比較 (±s)Table 2 Comparison of multidrug resistance gene mRNA relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

注:與未轉染比較，*P＜0.05;與無關對照序列轉染比較，△P＜0.05

處理因素 MDR1/P-gp MRP-1 GST-πLRP未轉染 0.980±0.101 0.876±0.116 0.951±0.073 1.117±0.121無關對照序列轉染 0.969±0.148 0.853±0.103 0.910±0.099 1.027±0.125 miR-185模擬物轉染 0.253±0.038＊△ 0.325±0.061＊△ 0.566±0.065＊△ 1.119±0.187 F 值＜0.001 ＜0.001 0.002 0.699 46.565 31.472 20.791 0.383 P值

2.4 細胞株SGC7901/ADR經轉染后多藥耐藥基因蛋白相對表達水平 經不同轉染處理后，細胞株SGC7901/ADR LRP蛋白相對表達水平比較，差異無統計學意義 (P＞0.05)。經不同轉染處理后，細胞株SGC7901/ADR MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π蛋白相對表達水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.05)。其中，miR-185模擬物轉染后細胞株SGC7901/ADR MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π蛋白相對表達水平低于未轉染和無關對照序列轉染 (P＜0.05，見表3)。

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，治療效果不佳，其重要原因是胃癌細胞的MDR常導致化療失敗［6-7］，胃癌MDR機制并進行逆轉已成為目前研究的熱點。然而，目前尚未發現導致胃癌細胞MDR的關鍵基因和確切逆轉MDR的藥物。因此，尋找在胃癌細胞MDR中發揮作用的新基因并分析其作用機制有重要意義。

表3 不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因蛋白相對表達水平的比較 (±s)Table 3 Comparison of multidrug resistance protein relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

表3 不同轉染處理后的細胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因蛋白相對表達水平的比較 (±s)Table 3 Comparison of multidrug resistance protein relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

注:與未轉染比較，*P＜0.05;與無關對照序列轉染比較，△P＜0.05

處理因素 MDR1/P-gp MRP-1 GST-πLRP未轉染 0.777 ±0.110 0.825 ±0.105 0.807±0.069 0.534±0.069無關對照序列轉染 0.799 ±0.121 0.799 ±0.118 0.790±0.097 0.560±0.075 miR-185模擬物轉染 0.367±0.055＊△ 0.326±0.035＊△ 0.433±0.066＊△ 0.520±0.079 F 值0.003 0.001 0.002 0.807 17.904 27.133 21.670 0.221 P值

microRNA由于對下游基因具有強大的調節功能而成為近期腫瘤研究的熱點。研究表明，miR-21、let-7、miR-27等多個microRNA均與胃癌相關［8-10］。miR-185是新近發現與惡性腫瘤關系密切的microRNA，參與多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、遷移，并與子宮內膜癌細胞對順鉑的耐藥性相關［3-5］。而關于miR-185與胃癌MDR關系目前研究很少。本研究發現，胃癌組織miR-185相對表達水平低于癌旁組織，耐藥細胞株SGC7901/ADR miR-185相對表達水平低于正常胃上皮細胞株GES-1和胃腺癌細胞株SGC7901，提示miR-185可能參與胃癌MDR的發生。以miR-185模擬物轉染細胞株SGC7901/ADR，使miR-185表達上調，細胞對化療藥物的敏感性明顯增強，證實miR-185參與了胃癌MDR調節，上調miR-185有逆轉胃癌細胞MDR特性的作用，有可能成為今后治療胃癌的靶基因，具有進一步深入研究的價值。

miR-185參與胃癌MDR的機制在于miR-185可介導其靶基因沉默，故本研究進一步從分子水平對miR-185上調后細胞中胃癌MDR基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP的mRNA及其蛋白表達水平變化進行檢測。MDR1/P-gp、MRP-1基因是腫瘤MDR經典途徑的代表基因，其表達蛋白存在于腫瘤細胞膜上，可將化療藥物泵出細胞外而導致MDR［11-12］;GST-π蛋白具有降解細胞內藥物的功能，能使藥物解毒成為無害物質而排出細胞外［13］;LRP則可以阻止藥物進入細胞核或將藥物泵出細胞核外，后通過胞吐作用將藥物排 出 細 胞［14］。本 研 究 發 現，細 胞 株 SGC7901/ADR經miR-185模擬物轉染，多藥耐藥基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，提示，miR-185對上述胃癌MDR基因具有抑制作用。同時，miR-185模擬物轉染并未影響LRP的表達，說明miR-185可能僅通過調節部分胃癌MDR基因而參與胃癌MDR。

綜上所述，胃癌細胞miR-185表達下調，通過上調miR-185的表達可提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性，其機制可能是miR-185調控部分多藥耐藥基因的表達。本研究結論提示miR-185有可能成為胃癌治療的新靶點，但本研究僅從分子水平進行了體外實驗，且miR-185對MDR基因調控的具體機制尚不完全明確，有待進一步體內研究及分子間作用機制研究予以闡明。

［1］ Li Y，Tan BB，Fan LQ，et al.Heterogeneity of COX-2 and multidrug resistance between primary tumors and regional lymph node metastases of gastric cancer［J］.Tumori，2012，98(4):516-522.

［2］ Chen CT，Kim H，Liska D，et al.MET activation mediates resistance to lapatinib inhibition of HER2-amplified gastric cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2012，11(3):660-669.

［3］ Li X，Chen YT，Josson S，et al.MicroRNA-185 and 342 inhibit tumorigenicity and induce apoptosis through blockade of the SREBP metabolic pathway in prostate cancer cells［J］.PLoS One，2013，8(8):e70987.

［4］ QuF，CuiX，HongY，et al.MicroRNA-185suppresses proliferation，invasion， migration， and tumorigenicity of human prostate cancer cells through targeting androgen receptor［J］.Mol Cell Biochem，2013，377(1/2):121-130.

［5］ Xiang Y，Ma N，Wang D，et al.MiR-152 and miR-185 cocontribute to ovarian cancer cells cisplatin sensitivity by targeting DNMT1 directly:a novel epigenetic therapy independent of decitabine［J］.Oncogene，2014，33(3):378-386.

［6］ Huang S，Chen M，Shen Y，et al.Inhibition of activated Stat3 reverses drug resistance to chemotherapeutic agents in gastric cancer cells［J］.Cancer Lett，2012，315(2):198-205.

［7］ Fang S，Zhu W，Zhang Y，et al.Paeoniflorin modulates multidrug resistance of a human gastric cancer cell line via the inhibition of NF-κB activation ［J］.Mol Med Rep，2012，5(2):351-356.

［8］ Yang SM，Huang C，Li XF，et al.miR-21 confers cisplatin resistancein gastric cancercellsby regulating PTEN ［J］.Toxicology，2013(306):162-168.

［9］ Li ZH，Pan XM，Han BW，et al.A let-7 binding site polymorphism rs712 in the KRAS 3'UTR is associated with an increased risk of gastric cancer［J］.Tumour Biol，2013，34(5):3159-3163.

［10］ Zhao X，Yang L，Hu J.Down-regulation of miR-27a might inhibit proliferation and drug resistance of gastric cancer cells［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011(30):55.

［11］ Zhang H，Wang J，Cai K，et al.Downregulation of gene MDR1 by shRNA to reverse multidrug-resistance of ovarian cancer A2780 cells［J］.J Cancer Res Ther，2012，8(2):226-231.

［12］ Lu D，Xiao Z，Wang W，et al.Down regulation of CIAPIN1 reverses multidrug resistance in human breast cancer cells by inhibiting MDR1 ［J］.Molecules，2012，17(6):7595-7611.

［13］ Li Y，Tan BB，Zhao Q，et al.Tumor chemosensitivity is correlated with expression of multidrug resistance associated factors in variously differentiated gastric carcinoma tissues［J］.Hepatogastroenterology，2013，60(121):213-216.

［14］ Zhang KG，Qin CY，Wang HQ，et al.The effect of TRAIL on the expression of multidrug resistant genes MDR1，LRP and GST-π in drug - resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR ［J］.Hepatogastroenterology，2012，59(120):2672-2676.