新疆漢族和哈薩克族兒童維生素D受體基因多態性與超重或肥胖的關系研究

王紅清，徐佩茹，李 敏，劉新彩，周廣花

肥胖是引發機體發生高血壓、心腦血管疾病、糖尿病等多種慢性疾病的主要誘因［1］，尤其是兒童時期的肥胖很有可能延續至成人階段，而且始于兒童時期的肥胖比成人后肥胖的人群更易患各種慢性疾病［2-3］。因此，兒童肥胖已成為公共衛生領域的研究熱點。目前多項研究顯示，維生素D水平與肥胖顯著相關［4-6］。但關于維生素D受體 (VDR)基因多態性與肥胖的關系國內外研究甚少且結論不一致。本研究對新疆伊犁地區漢族和哈薩克族學齡兒童VDR基因ApaⅠ(A/C)(rs7975232)、BsmⅠ (C/T)(rs1544410)位點多態性進行分析，旨在探討VDR基因ApaⅠ、BsmⅠ位點多態性與漢族、哈薩克族學齡兒童超重/肥胖的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年5—6月在新疆伊犁哈薩克自治州各縣、市、鄉采用整群抽樣的方法，抽取8所小學中7～12歲超重/肥胖學齡兒童250例為病例組，其中漢族127例 (女47例，男80例)，哈薩克族123例 (女48例，男75例);選取同時期年齡、性別與病例組匹配的非超重/肥胖健康學齡兒童255例為對照組，其中漢族131例 (女44例，男87例)，哈薩克族124例 (女52例，男72例)。兩組均排除由代謝、內分泌、遺傳及中樞神經系統等疾病所致肥胖及肥胖綜合征。家屬均簽署知情同意書，本研究得到醫院倫理委員會批準。采用體質量低于同年齡、同性別的第85百分位為健康學齡兒童，超過同年齡、同性別的第85百分位為超重/肥胖學齡兒童［7］。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 按經典酚-氯仿-異戊醇法從血白細胞中提取基因組DNA，用可見紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度和純度，置-20℃冰箱冷凍保存，用作PCR反應模板。

1.2.2 引物設計與合成 (1)ApaⅠ位點上游引物:5'-AAGGAGAGGCAGCGGTACT-3'，下游引物:5'-CCGGTCAGTCATAGAGG-3'〔由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成〕;(2)BsmⅠ位點:參照文獻 ［8］，上游引物:5'-CAACAAAGACTACAAGTACCGCGTCAGT GA-3'，下游引物:5'-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGG G-3'〔由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成〕。

1.2.3 PCR 反應 PCR 25 μl反應體系:模板 DNA 3 μl，重 蒸 水 (ddH2O)8.5 μl，2 × Apa Master MIX 12.5 μl〔生工生物工程 (上海)股份有限公司〕，上游引物與下游引物各0.5 μl。PCR反應條件:94℃預變性3 min，35個循環〔95℃變性 30 s，62℃退火(ApaⅠ)、56℃退火 (BsmⅠ)30 s，72℃延伸1 min〕，72℃延伸5 min后，用PCR擴增儀擴增，PCR片段長度為329 bp(ApaⅠ)、822 bp(BsmⅠ)。PCR反應產物經由 1.5%(ApaⅠ)、1.0%(BsmⅠ)瓊脂糖凝膠電泳，100 V恒壓電泳25 min，利用紫外線凝膠成像系統檢測擴增結果并照相記錄。

1.2.4 酶切 取 PCR產物5 μl，加入限制性內切酶0.5 μl(Thermo 公 司)、10 × 緩 沖 液 2 μl，ddH2O 8.5 μl，混勻后置65 ℃酶解 30 min(ApaⅠ)、37 ℃酶解過夜 (BsmⅠ)。反應產物以PCR Markers〔生工生物工程 (上海)股份有限公司〕作為DNA片段的標準對照物，PCR 酶 解 產 物 由 2.0% (ApaⅠ)、1.5%(BsmⅠ)瓊脂糖凝膠，溴化乙啶染色，于100 V恒壓電泳25 min，利用紫外線凝膠成像系統檢測并照相記錄，判讀基因型。

1.2.5 基因型判定 ApaⅠ位點:純合子基因型 (aa)出現88 bp、241 bp 2條帶，雜合子基因型 (Aa)出現329 bp、241 bp、88 bp 3條帶，純合子基因型 (AA)僅出現329 bp 1條帶 (見圖1);BsmⅠ位點:純合子基因型 (bb)出現646 bp、176 bp 2條帶，雜合子基因型(Bb)出現822 bp、646 bp、176 bp 3條帶，純合子基因型 (BB)僅出現822 bp 1條帶 (見圖2)。

1.2.6 基因測序 選取部分標本的PCR產物送至華大生物工程技術服務有限公司進行測序，進一步驗證擴增目的片段酶切后的分型是否正確，部分測序結果見圖3、4。

1.3 質量控制 調查人員均為兒科專業，經過培訓和上崗考核，調查儀器均經過校正;隨機抽取10%的樣本，重復檢測基因型;選取部分標本的PCR產物進行測序，驗證擴增目的片段酶切后的分型是否正確。

圖1 ApaⅠ位點多態性電泳圖Figure 1 Electrophoretogram for ApaⅠpolymorphism

本研究創新點:

多項研究結果表明，新疆哈薩克族人群是肥胖的高發人群，推測認為可能與特定的遺傳因素相關。本研究以新疆伊犁地區7～12歲漢族和哈薩克族學齡兒童為研究對象，采用病例對照研究方法，運用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測漢族、哈薩克族學齡兒童維生素D受體 (VDR)基因ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布情況及等位基因頻率，并比較兩民族ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率的差異，不僅豐富了不同民族VDR基因的遺傳學資源庫，而且判別了VDR基因是否是漢族、哈薩克族學齡兒童新的肥胖易患基因。從基因學方面對漢族、哈薩克族超重/肥胖學齡兒童進行研究，可明確兩族肥胖遺傳因素是否存在異質性，且對兩族兒童肥胖的易患性起到預示作用，進而為兩族兒童肥胖的防治提供分子遺傳學線索，具有積極的促進作用。

圖2 BsmⅠ位點多態性電泳圖Figure 2 Electrophoretogram for BsmⅠpolymorphism

圖3 Aa基因型測序圖Figure 3 Sequencing diagram of the Aa genotype

圖4 Bb基因型測序圖Figure 4 Sequencing diagram of the Bb genotype

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗采用χ2檢驗;兩組民族、性別構成及基因型分布、等位基因頻率比較采用χ2檢驗;計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 對照組與病例組漢族和哈薩克族兒童性別、年齡比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 對照組與病例組兒童一般資料比較Table 1 Comparison of general characteristics between control group and case group

2.3 漢族與哈薩克族健康學齡兒童ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較 漢族與哈薩克族健康學齡兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表2)。

漢族與哈薩克族健康學齡兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表 3)。

2.4 對照組與病例組兒童ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較 對照組與病例組漢族兒童ApaⅠ位點基因型分布比較，差異無統計學意義 (P＜0.05)，等位基因頻率比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);對照組與病例組哈薩克族兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表 4)。

對照組與病例組漢族及哈薩克族兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05，見表5)。

2.5 對照組與病例組漢族及哈薩克族兒童兩位點突變情況比較 對照組與病例組漢族兒童兩位點突變情況比較，差異均無統計學意義 (χ2=3.73，P=0.15，見表6);對照組與病例組哈薩克族兒童兩位點突變情況比較，差異均無統計學意義 (χ2=0.29，P=0.96，見表7)。

表2 漢族與哈薩克族健康學齡兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 2 Comparison of distribution of ApaⅠgenotype and allele gene frequency between Han healthy school-aged children and Kazakh healthy school-aged children

表3 漢族與哈薩克族健康學齡兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 3 Comparison of distribution of BsmⅠgenotype and allele gene frequency between Han healthy school-aged children and Kazakh healthy school-aged children

表4 對照組與病例組兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 4 Comparison of distribution of ApaⅠgenotype and allele gene frequency between control group and case group

表5 對照組與病例組兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 5 Comparison of distribution of BsmⅠgenotype and allele gene frequency between control group and case group

表6 對照組與病例組漢族兒童兩位點突變情況比較 (例)Table 6 Comparison of the mutation of ApaⅠ and BsmⅠ among Han children between control group and case group

表7 對照組與病例組哈薩克族兒童兩位點突變情況比較 (例)Table 7 Comparison of the mutation of ApaⅠ and BsmⅠ among Kazakh children between control group and case group

3 討論

Wong等［9-10］通過敲除VDR基因野生型小鼠，結果顯示，基因敲除小鼠的耗氧量和CO2產生量均明顯高于野生型小鼠，體內能量消耗減少，誘導肥胖的發生。進一步研究發現，VDR通過調節解偶聯蛋白 (UCP)的表達來抑制前脂肪細胞分化為脂肪細胞，可減少脂肪的生成，從而抑制肥胖的發生［11］。但目前關于人類VDR基因與肥胖易患性的研究較少，且在不同的人群研究中尚未得出統一的結論。Vimaleswaran等［12］通過研究5 224例45歲英國人群BMI與VDR間的關聯性，共選取VDR的26個單核苷酸多態性 (SNPs)，結果提示，VDR基因不太可能是引起英國成人肥胖發生的主要基因。但對同樣屬于歐洲的法國人來說，TaqⅠ位點的TT基因型和BsmⅠ位點的bb基因型與其他基因型人群相比，BMI增加了4 kg/m2(或體質量增加了9 kg)，使肥胖發生率增加了30%［13］。波蘭學者以351例50～60歲絕經后健康婦女為研究對象，結果顯示，BsmⅠ位點與BMI間無明顯相關性［14］。但對絕經前健康美國婦女的研究發現，BsmⅠ位點的bb基因型與體質量增加有關［13］。對瑞典絕經前的健康婦女和法國兒童研究也同樣發現，BsmⅠ位點的bb基因型與脂肪量和體質量增加有關［13］。以上研究說明，在歐洲人群中VDR基因多態性與BMI或肥胖間的關聯研究存在差異。同樣在亞洲和非洲也得到相似的結論。Al-Daghri等［15］通過研究402例肥胖 (BMI≥30 kg/m2)和489例健康 (BMI＜30 kg/m2)沙特阿拉伯兒童人群，結果顯示，TaqⅠ和BsmⅠ位點與肥胖具有相關性，ApaⅠ與肥胖無明顯相關性，但ApaⅠ與TaqⅠ、BsmⅠ組成的單倍體GTA和ACC與肥胖具有相關性。但在Al-Daghri等［16］的另外一項研究中，以沙特阿拉伯285例代謝綜合征和285例健康對照人群為研究對象，結果顯示，BsmⅠ位點B等位基因與肥胖相關，是肥胖的危險因素，但TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ均與肥胖無相關性。Dorjgochoo等［17］以6 922例25～70歲上海女性為研究對象，結果顯示，VDR基因與BMI間無相關性。Xu等［18］通過研究260例中國健康絕經后婦女，結果顯示，ApaⅠ位點與BMI具有相關性。上海學者以來自400個家庭的1 215例參與者為研究對象，發現ApaⅠ、FokⅠ與BMI間無明顯相關性，尾型同源盒轉錄因子2(CDX-2)與BMI有關［19］。以上研究結果表明，VDR基因多態性與肥胖間的相關性，不僅存在位點差異，而且具有民族、地域、性別等差異。考慮到基因位點的突變率在不同年齡、民族、種族等均存在差異，同時東西方的生活方式及環境因素不同，所以為驗證VDR基因多態性與肥胖的相關性，有必要進行大規模、多地區的研究。

目前，關于人類VDR基因與肥胖的關系研究甚少且結論不統一，且研究對象多為成人，對兒童研究甚少。本研究以新疆伊犁地區7～12歲漢族和哈薩克族學齡兒童為研究對象，結果顯示，漢族健康學齡兒童ApaⅠ位點a等位基因頻率為68.3%，a為優勢基因，與趙金秀等［20］、席衛平等［21］報道相近;哈薩克族屬于高加索人種，A、a等位基因頻率基本相等，與Riggs等［22］研究一致;漢族健康學齡兒童BsmⅠ位點分布不均衡，其中b等位基因占絕對優勢，與趙江霞等［23］研究一致，漢族等位基因頻率與韓國人的相似［24］，但低于白種人［25］。哈薩克族健康學齡兒童BsmⅠ位點多態性的分布以bb(62.9%)和Bb(35.5%)型為主，與陳瑞英等［26］研究結果 bb(47.0%)和 Bb(48.0%)不同，可能與不同研究的樣本選擇有關。這表明ApaⅠ、BsmⅠ位點多態性分布均有明顯的種族差異。

本研究結果還顯示，ApaⅠ位點的A、a等位基因在新疆伊犁地區病例組與對照組漢族學齡兒童間有差異，而兩組哈薩克族學齡兒童間無差異，提示ApaⅠ位點可能與漢族學齡兒童超重/肥胖有關，而與哈薩克族學齡兒童超重/肥胖無關。Al-Daghri等［15］研究沙特阿拉伯成人人群，結果顯示，ApaⅠ位點與肥胖無相關性，但與其TaqⅠ、BsmⅠ位點組成的單倍體GTA和ACC與肥胖有關。Xu等［18］與 Binh等［8］均通過研究絕經后健康婦女顯示，ApaⅠ位點與BMI具有相關性。在沙特阿拉伯成人人群，BsmⅠ位點與肥胖具有相關性，等位基因B是肥胖的危險因素，且與TaqⅠ、BsmⅠ位點組成的單倍體ACC和GTA均與肥胖有關［14-15］。以健康婦女為研究對象，發現BsmⅠ位點的bb基因型與體質量增加有關［13］。對瑞典絕經前健康婦女、法國兒童的研究也同樣發現，BsmⅠ位點的bb基因型與脂肪量和體質量增加有關［13］。但同樣以健康婦女為研究對象，波蘭學者研究顯示，BsmⅠ位點與BMI無相關性［27］。同時，本研究還發現，兩位點的交互作用與漢族、哈薩克族超重/肥胖學齡兒童亦無相關性。但在法國高加索人群的研究發現，VDR基因TaqⅠ位點TT基因型和BsmⅠ位點bb基因型間的交互作用與其他基因型組合的人群相比，體質量增加了9 kg(或BMI增加了4 kg/m2)，且增加了30%的肥胖發生率［28］。

以上研究結果表明，關于VDR基因多態性與超重/肥胖間的相關性研究，國內外的學者研究結論不一致，有些甚至相互矛盾，出現上述現象的原因可能是:(1)樣本的來源不同:不同民族、不同人種間具有明顯遺傳異質性，從人種學分類來說，漢族、日本和韓國屬于蒙古人種，哈薩克族、維吾爾族和歐美國家同屬高加索人種;(2)肥胖與基因的相關性研究存在諸多混雜因素，如群體的分層現象是一個極其重要但又常被忽視的混雜因素，同時環境因素也不可忽視，而環境因素的差異，致使遺傳因素與環境因素間的相互作用使肥胖病因的研究更加復雜;(3)不同年齡段的人群遺傳負荷不同，隨著年齡的增長，遺傳因素對肥胖的影響逐漸減弱，而環境因素對肥胖的影響逐漸增強。因此，在不同地區、不同人種人群，甚至是不同年齡段中進行大樣本多基因的研究，比較不同地區、不同人種、不同年齡段的遺傳學因素非常重要。肥胖是由多個微效基因相互作用的慢性代謝性疾病，其發生和發展并不是簡單的遵從孟德爾遺傳模式，而是由多個基因參與，受多種因素相互影響的結果。一般來說，單個基因位點可能對肥胖的影響較小，而多個基因位點的聯合作用卻能顯著放大這種作用。

本研究不足:(1)PCR-RFLP方法難以發現低頻率、高外顯但可能具有較強易患性的基因位點，這些變異位點可能比目前發現的變異位點的效應更強。因此，需要利用基因定位或測序方法來識別這些重要的變異基因位點;(2)本研究對象僅為新疆伊犁地區漢族、哈薩克族7～12歲學齡兒童群體，未涉及居住于當地的其他民族及其他地區的同齡兒童;且由于樣本量的限制，未進行肥胖分度分析。作為基因多態性的相關性研究，研究結果不能推廣到整個人群，研究尚顯不足;(3)本研究為病例對照研究，選擇性偏倚難以避免，混雜因素也不能完全排除，可能會夸大或者削弱基因與疾病之間的關聯強度。今后本課題組將繼續致力于新疆學齡兒童肥胖的多基因位點及多因素的研究，為進一步探討學齡兒童肥胖的作用機制提供一定的理論基礎。

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