地衣芽孢桿菌的生長及對養殖水體中殘餌的降解特性

杭小英　周冬仁　羅毅志等

摘要：從自然養殖池塘中篩選獲得了1株能有效抑制水產養殖常見致病菌的功能菌株DSY002-2011，經鑒定為地衣芽孢桿菌。通過人工模擬養殖水體中殘餌濃度，研究地衣芽孢桿菌對飼料中蛋白質、淀粉的降解特性。結果表明，分離株DSY002-2011在水溫28 ℃、pH值7的1%飼料培養液中培養24 h后，對飼料蛋白質、淀粉的降解率分別達到58.8%、62.9%，說明在養殖水體中添加地衣芽孢桿菌對水體殘余餌料的降解是非常有效的。地衣芽孢桿菌降解蛋白質、淀粉的合適條件為pH值6～7、鹽度0～1.0%。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；降解；鹽度；pH值

中圖分類號： X714 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0206-02

在高密度、集約化的水產養殖過程中，由于缺乏科學規范的養殖管理，養殖戶一味追求高產量往往會過度投餌，導致養殖水體中積存了大量殘余餌料，加上養殖動物的排泄物，使得養殖水體中的有機物濃度增加，水質環境惡化，從而誘發各類水產疾病。微生態制劑的調控技術已成為解決養殖水體污染病害問題的有效手段之一[1-2]。以往研究表明，硝化細菌[3]、光合細菌[4]、芽孢桿菌[5-6]等有益菌在減少病害、凈化水質和促進動物生長等方面均有顯著效果，但對降解水體殘余餌料蛋白質、淀粉的功能研究報道較少。本試驗用從自然養殖池塘篩選到的1株地衣芽孢桿菌DSY002-2011，對其餌料蛋白質、淀粉的降解特性進行研究，獲得其降解規律，為養殖水體的飼料殘餌去除探求一種更為有效的辦法，也為今后在水產養殖中科學使用地衣芽孢桿菌制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformi）DSY002-2011由筆者所在實驗室分離、鑒定并保存。

1.1.2 飼料 市售鱉配合飼料，由優質白魚粉、淀粉、酵母粉、維生素、礦物質等組成。

1.1.3 藥品與試劑 菌株生長及試驗所需藥品與試劑：營養肉湯培養基、0.85%無菌生理鹽水、氯化鈉、蒸餾水、氫氧化鈉溶液、稀鹽酸等。

淀粉測定所需藥品與試劑：碘、碘化鉀、硝酸鈣[Ca（NO3）2·H2O]、可溶性淀粉。

蛋白質測定所需藥品與試劑：硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀、硫酸、20 g/L硼酸溶液、混合指示液（1份1 g/L甲基紅乙醇溶液與5份1 g/L溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合）、400 g/L氫氧化鈉溶液、0.050 0 moL/L硫酸標準溶液。所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

1.1.4 儀器 生化培養箱、振蕩培養箱、離心機、分光光度計、凱氏定氮儀、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、取樣器、試管、培養皿等。

1.2 方法

1.2.1 1%飼料培養基 鱉飼料1.0 g，純凈水100 mL，混合后溶解均勻。

1.2.2 菌株生長與養殖水體中飼料殘餌降解的關系

將保存的地衣芽孢桿菌DSY002-2011在普通營養肉湯培養基上培養24h，接種于pH值為7、滅菌后的1%鱉飼料培養基，28 ℃ 振蕩培養。接種后在0、24、48、72、96、120 h時取樣測定（從24 h時開始測定）、蛋白質含量、淀粉含量。

1.2.3 初始pH值對地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

配制1%鱉飼料培養基5份，pH值分別調為5、6、7、8、9，滅菌后接種地衣芽孢桿菌，28 ℃振蕩培養，培養至72 h時取樣測定蛋白質、淀粉含量。

1.2.4 鹽度對地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

配制pH值為7的1%鱉飼料培養基6份，鹽度分別為0、0.5%、10%、1.5%、2.0%，滅菌后接種地衣芽孢桿菌，28 ℃振蕩培養，培養至72 h時取樣測定蛋白質、淀粉含量。

1.2.5 細菌計數及細菌蛋白氮測定

地衣芽孢桿菌DSY002-2011接種于普通營養肉湯中，28 ℃搖床培養24 h。將細菌培養液于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用生理鹽水反復吹打，重復以上步驟3次。將細菌懸液進行適當稀釋，分別用血球計數板法（此方法可測得活菌和死菌的總量）和平板菌落計數法（此方法測得活菌數量即細菌生長量）進行計數，計算兩者的比例。

細菌培養液潤洗后于10 000 r/min離心10 min，棄液體，平鋪在濾紙上，37 ℃鼓風干燥30 min，稱質量，計算1 g細菌的數量（活菌和死菌的總量），并通過干燥恒重法（105 ℃）測定細菌水分含量，從而得出1 g細菌干物質的質量，再測定 1 g 細菌干物質中的氮元素，采用半微量凱氏定氮法[7]。

1.2.6 飼料蛋白質降解率的計算

地衣芽孢桿菌的生長并不會使培養液中氮總量發生變化，只是將飼料蛋白質轉化成了細菌蛋白質，所以轉化的飼料蛋白質可以根據地衣芽孢桿菌培養前后含量變化來換算。培養前的初始飼料蛋白質含量由半微量凱氏定氮法測定，氮換算為蛋白質的系數是6.25。

飼料蛋白質降解率=細菌生長轉化的飼料蛋白質含量/培養前飼料蛋白質含量×100%。

1.2.7 飼料淀粉降解率的測定

淀粉含量的測定采用碘顯色法[8]。飼料淀粉降解率=（培養前淀粉濃度-培養后淀粉濃度）/培養前淀粉濃度×100%。

2 結果與分析

2.1 細菌計數及細菌蛋白氮測定

平板計數法測得地衣芽孢桿菌活菌濃度為9.8×1010 CFU/mL，血球計數板法測得24 h培養的地衣芽孢桿菌數量為3.0×1011 CFU/mL，兩者比例為1 ∶3.06。測得1 g地衣芽孢桿菌為5.3×1011個，細菌菌體水分含量為76%。半微量凱氏定氮法測得1 g地衣芽孢桿菌干物質中含氮量為128%。測得2 mL模擬殘餌培養基蛋白質含量為0.010 2 g， 100 mL培養瓶中飼料蛋白含量為0.51 g。

2.2 地衣芽孢桿菌生長與水體中飼料殘餌降解的關系

經半微量凱氏定氮法測定，1%鱉飼料培養基中的初始飼料蛋白質含量為5.1 mg/mL。在pH值為7的含1%鱉飼料培養基中，接種地衣芽孢桿菌后于28 ℃振蕩培養，表1結果表明，在培養液中，細菌數量迅速增加，并在96 h達到最大值；接種后24 h飼料蛋白質、淀粉降解率分別為588%、629%；蛋白質降解率在96 h時達到最大值74.5%，淀粉降解率在72 h時達到最大值72.1%。由此說明，在培養液中地衣芽孢桿菌的生長與蛋白質、淀粉的降解具有同步的相關性。

2.3 初始pH值對地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

圖1結果表明，pH值為6～7時，地衣芽孢桿菌對蛋白質和淀粉的降解效果比較好，在pH值為7時，蛋白質、淀粉降解率達到最大值，分別為72.5%、72.1%。另外，pH值為 5～9 條件下，地衣芽孢桿菌飼料蛋白質、淀粉降解率均接近或高于60%，說明菌株降解飼料殘餌能力受pH值影響較小。

2.4 鹽度對地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

由圖2可見，鹽度為0～2.0%條件下，地衣芽孢桿菌的蛋白質降解率在50.2%～72.5%之間，淀粉降解率在 61.7%～72.1% 之間；鹽度為0時，地衣芽孢桿菌的蛋白質、淀粉降解率均最高，隨著鹽度增加，蛋白質、淀粉降解率均逐漸下降；鹽度超過1.0%后，蛋白質降解率下降更快。試驗結果表明，在鹽度為0～1.0%條件下，地衣芽孢桿菌對飼料蛋白質、淀粉的降解效果較好。

3 結論與討論

高密度的養殖水體中，水質的污染主要來源于大量殘余餌料、養殖動物的糞便以及浮游生物的尸體等[9]，這些有機物的主要成分是蛋白質和淀粉。這種水質污染情況會隨著養殖期的發展越來越嚴重，尤其到養殖后期，成為各種病害頻發的誘因。本試驗從自然養殖池塘篩選到1株地衣芽孢桿菌DSY002-2011，對其飼料蛋白質、淀粉的降解特性進行研究，結果表明，該菌株在水溫28 ℃、pH值為7的1%飼料培養液中培養24 h后，對飼料蛋白質、淀粉的降解率分別達到588%、62.9%，說明在養殖水體中添加地衣芽孢桿菌對水體殘余餌料的降解是非常有效的。有研究報道，地衣芽孢桿菌能產生多種具有重要生物活性的胞外產物，如肽類或非肽類的抗菌物、小分子活性物質及多種胞外消化酶[10]，因此它可促進養殖水體的營養循環，從而凈化水質[11-13]。

在實際應用中，地衣芽孢桿菌的生長、產酶能力及胞外產物的活性均會受到水質環境因子的影響[14]，如溫度、鹽度和pH值等除了影響菌株的生長，也會影響菌株的酶系活性[15]，從而影響菌株對飼料蛋白質、淀粉的降解能力。本試驗中，較合適的降解條件為偏酸性至中性（pH值6～7） 、 適溫（25～30 ℃） 、低鹽濃度（0～1.0%），這與謝航等的研究結果[16]一致。朱彥博等研究表明，隨著鹽度增加，菌株相對蛋白酶的活性趨于減弱[17]，這與本研究蛋白降解率隨著鹽度增加而降低的結果一致。另外，從很多報道看，不同菌株在相同pH值條件下蛋白酶活性存在顯著差異[14，17-18]，最大酶活性出現在pH值7.0～10.5之間不等，這可能是因為涉及了不同地衣芽孢桿菌菌株，說明不同菌株的最適pH值是存在差異的，在今后工作中，要特別注意不同菌株環境因子的研究。

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