華木蓮葉中內生真菌的群落結構

劉紫英+冷桂華+周秀玲

摘要：為了解我國特有珍稀植物華木蓮葉片的內生真菌菌群結構特征，以華木蓮葉片為材料，采用組織分離法分離華木蓮的內生真菌。結果表明，PDA改良培養基（PDA培養基內加20 g/L華木蓮葉汁液、30 mg/L 鏈霉素）的分離效果最好。從華木蓮的葉中共分離得到87株內生真菌，經顯微形態鑒定，鑒定菌株74株，為4目5科10屬，分別為青霉屬、木霉屬、曲霉屬、小孢霉屬、交鏈孢屬、枝孢屬、長蠕孢屬、鐮孢霉屬、擬莖點霉屬、絲核菌屬，結果顯示葉中內生真菌菌群多樣性較豐富，優勢屬為無性絲孢類菌群中青霉屬、木霉屬、交鏈孢屬和無性腔孢類擬莖點霉屬；分離率分別為17.2%、12.6%、10.4%和11.5%，對開發和利用植物內生真菌及豐富真菌的物種具有重要意義。

關鍵詞：華木蓮；內生真菌；分離；鑒定

中圖分類號： S567.23+9.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0316-03

華木蓮（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng），別稱落葉木蓮， 為木蘭科單種屬植物，是我國江西省宜春市特有的珍稀瀕危新樹種，僅狹域分布于宜春市境內明月山山地，落葉喬木，1995年被列入國務院公布的“國家重點保護野生植物名錄”中國家I級重點保護植物[1-3]，同時被英國皇家植物園收編在冊，華木蓮保護工程已被列入國家重點植物21種極小種群的保護工程。目前，國內外對華木蓮的報道主要集中在華木蓮生物學特性及繁殖技術、保護生物學、遺傳多樣性及群落種間聯結性等方面[4-6]，施建敏等對華木蓮葉黃酮類化合物抗氧化作用、多糖的提取及其抗氧化作用進行了研究，結果顯示，華木蓮葉內多糖和黃酮類化合物有較好的抗氧化性，華木蓮具有潛在的利用價值[7-8]。

植物內生真菌是近30年國內外真菌資源多樣性和分類學的研究熱點之一。在許多藥用植物和重要價值植物體內，內生真菌的組成和分布得到了比較深入的研究[9-11]，但是植物內生真菌具有豐富的多樣性，特有植物可能具有特殊的內生真菌區系組成。現有研究表明，內生真菌能夠產生與宿主植物相同或相似的化學成分[12]。因此，開發和利用植物內生真菌對于豐富真菌的種類、探討真菌和宿主的相互作用和協同進化等都具有重要意義，在保護植物種質資源、分離新的產物和新的活性成分等方面都具有重要的價值。到目前為止，對華木蓮內生真菌國內外還沒有研究報道，因此筆者以珍稀植物華木蓮葉為試驗材料，分離鑒定其內生真菌，為華木蓮葉中內生真菌種群多樣性分析提供基礎，同時保護珍稀植物為江西省的植物資源開發開辟了新途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料為華木蓮新鮮健康葉片，取于江西省宜春市明月山風景區周邊林木種植場。葉片摘取后，用自來水沖洗干凈備用。

1.2 培養基

采用改良PDA培養基：200 g 馬鈴薯（煮汁）+20 g 葡萄糖+20 g華木蓮葉（煮汁）+20 g瓊脂，加水定容至 1 000 mL。臨用前加入30 mg/L 氯霉素。

1.3 內生真菌分離

選用健康植株的葉片，用自來水沖洗干凈，切段；超凈工作臺上，無菌水清洗2～3次；75%乙醇消毒2 min，無菌水清洗4次；0.1% HgCl2消毒，消毒時間設1、2、2.5、3、3.5、4 min等6個梯度，以考察其最佳消毒時間，無菌水清洗6次，無菌濾紙吸干水分；用無菌刀片將葉片切成5 mm×5 mm的小片，分別置于培養基中，26 ℃恒溫培養5～7 d，待組織塊周圍菌絲生長旺盛時再挑取部分菌絲轉接到新鮮培養基上進行純化培養。設無消毒對照和空白對照，將表面消毒后的葉片不作切割處理并放置在相同條件下培養，以確定是否徹底消毒。根據培養時間、菌落的生長速度和真菌的生長種類確定最佳消毒時間進行擴大培養；并對菌株進行編號，華木蓮的葉分離所得內生真菌分別標記為SL1、SL2、…、SL87。

1.4 內生真菌的鑒定

采用點植法、膠帶粘貼法、真菌學插片培養法及真菌玻片培養法制成玻片，置于高級數碼生物顯微鏡SK-DM500光學攝像儀下攝像，觀察菌絲形態、產孢結構及孢子形態，鑒定真菌種類[13-14]。對在人工培養條件下較少產孢的菌株采用菌落造傷、近紫外燈照射、冰箱短暫冷藏等方法誘導產孢。

2 結果與分析

2.1 HgCl2消毒時間的確定

0.1% HgCl2的消毒時間梯度處理結果顯示，在0.1% HgCl2消毒1 min的培養基內可以觀察到部分明顯的細菌菌落，2 min以上的消毒效果較好，明顯優于1 min，而4 min對鮮嫩葉的組織損害較大。2、2.5、3 min為比較合適的消毒時間，綜合分離菌群所得多樣性和消毒效果，試驗選取0.1% HgCl2處理2.5 min作為消毒處理時間，既能除去表面可能帶有的雜菌，又可避免因消毒時間過長而傷害組織，還能盡可能分離更多的內生真菌群落。

2.2 華木蓮內生真菌鑒定

用改良PDA平板培養基分離菌株，從菌落形態、菌體顯微形態2方面對所分離的內生真菌進行觀察，對照《真菌鑒定手冊》根據菌株的菌落形態特征、顏色、質地、生長培養基顏色變化以及菌絲體和孢子的形態特征進行鑒定，總共分離到內生真菌87株，已鑒定菌株75株，為4目5科10屬，均屬絲孢綱，分別為青霉屬、木霉屬、曲霉屬、小孢霉屬、交鏈孢屬、枝孢屬、長蠕孢屬、鐮孢霉屬、擬莖點霉屬、絲核菌屬（表1），可見華木蓮葉中內生真菌菌群多樣性豐富。

2.2 華木蓮內生真菌群落結構分析

表2顯示，華木蓮內生真菌均屬絲孢無性型真菌和腔孢無性型真菌。在目分類水平上，以絲孢目（Hyphomycetales）為優勢菌群，占65.5%。在科的分類水平上，叢梗孢科（Moniliaceae）、暗梗孢科（Dematiaceae）和球殼孢科（Sphaeropsidaceae）為優勢菌群，分別占總菌株數量的44.8%、15.0%、11.5%。在屬的水平上分類，絲孢無性型真菌中青霉屬、交鏈孢屬、木霉屬和腔孢類無性型真菌的擬莖點霉屬分別占所分離菌株數的172%、10.4%、16.1%和11.5%，為華木蓮內生真菌的優勢種群。因實驗室培養條件下不產孢，有8株菌株無法鑒定到歸屬的無孢菌群。這與傳統的真菌菌種鑒定主要通過菌落及顯微形態學觀察而作出判斷的局限性有關，因而在以后工作中將結合分子生物學以分離的內生真菌總DNA為研究對象，用ITS序列分析法對華木蓮的內生真菌進行進一步鑒定。endprint

3 結論與討論

內生真菌在植物體內分布不均衡，隨著外界環境的改變，在植物中內生真菌分布的種類、數量及生長狀況有所不同[15]。所以，在分離時要盡量模擬內生菌在其宿主體內自然狀態下的生活環境，以便能夠最大量地分離出內生菌。本研究對PDA培養基進行了改良，改良PDA培養基中添加了宿主植物華木蓮葉汁液，補充了華木蓮內生真菌可能需要的特殊營養，通過培養基篩選的前期試驗發現，在這種改良PDA培養基上華木蓮內生真菌菌群較豐富，但不能保證所有生活在組織內的真菌全部分離出來，可能有的內生真菌不能在人工培養基上生長，或者只能在其他選擇性培養基上生長。因此，盡量選擇多種分離培養基獲得多種群的內生真菌是必要的。

華木蓮內生真菌菌群較豐富，分屬于青霉屬、木霉屬、曲霉屬、小孢霉屬、交鏈孢屬、枝孢屬、長蠕孢屬、鐮孢霉屬、擬莖點霉屬、絲核菌屬。其中，絲孢無性型真菌的青霉屬、交鏈孢屬、木霉屬和腔孢類無性型真菌的擬莖點霉屬分別占所分離菌株數的17.2%、12.6%、11.5%和14.9%，為華木蓮內生真菌的優勢種群。植物內生真菌的生物多樣性受多種因素影響，同一植物在不同的地理區域或位點具有不同的內生菌類群。華木蓮僅生長于江西省宜春市明月山風景區，所以分離華木蓮葉中不存在不同地域種群的差異。

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