正交試驗法優選白術多糖的提取工藝

袁海梅，李鴻翔，彭 騰

(1.成都大學 生物工程學院，四川 成都 610106;2.成都中醫藥大學 藥學院 教育部中藥材標準化重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 610075)

0 引 言

白術多糖為白術的重要組成成分，研究發現，其具有多種藥理作用:增強大鼠神經細胞抗氧化能力及減少DNA 損傷［1］;可減輕自體肝移植大鼠肝臟缺血再灌注損傷［2］;對腺嘌呤誘發的慢性腎功能衰竭的大鼠腎臟具有一定的保護作用［3］;可以促進人外周血來源的樹突狀細胞表型及功能的成熟［4］;對嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、植物乳桿菌的促生長效果最佳，具有良好的促生長效果［5］;通過降低凋亡基因及蛋白的產生，上調抗凋亡基因及蛋白的產生，提高Bcl-2/Bax 的比值達到抗神經細胞缺氧性凋亡作用［6］.為了更好地開發利用白術這一植物資源，本研究以白術多糖收率為考察指標，以煎煮次數、煎煮時間、煎煮倍數為考察因素，采用正交實驗法優選白術多糖的最佳提取工藝，擬為白術多糖的進一步開發利用提供參考依據.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

試驗所用儀器包括:RE-2000B 型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵(鞏義予華儀器有限責任公司)，馬頭牌JYT-2型架盤藥物天平(上海醫用激光儀器廠)，UV-1100型紫外可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)，ZDZ5-WS 型離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司).

1.2 材 料

葡萄糖購于中國藥品生物制品鑒定所(批號，110833－200503);白術飲片購于四川新荷花藥材飲片有限公司(批號，0907034)，經成都中醫藥大學蔣桂華教授鑒定為正品;實驗所用溶劑均為分析純.

2 方 法

2.1 正交試驗設計［7－9］

根據藥材提取過程中的影響因素，選定煎煮次數(A)、煎煮時間(B)和煎煮倍數(C)3 個因素為考察指標，以精制多糖的收率為評價指標，不考慮各因素的相互影響.因素與水平設計如表1 所示.

表1 試驗因素水平表

2.2 對照品溶液制備

精密稱取葡萄糖對照品0.05134 g，加蒸餾水定容至50 mL，精密吸取5 mL 置50 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制得對照品溶液.

2.3 供試品溶液制備

稱取白術藥材粗粉30 g，按正交表設計實驗，煎煮，合并水煎液，抽濾，濾液減壓濃縮至100 mL，加入85%的乙醇調節至60%，放置24 h，以3 500 r/min 離心10 min，得白術粗多糖，采用95%的乙醇、丙酮依次洗滌，減壓干燥24 h，即得粗多糖.精密稱取白術粗多糖0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，加入蒸餾水，沸水浴中加熱30 min 溶解，放至室溫，定容至刻度.精密吸取10 mL，置100 mL 容量瓶中，搖勻，定容至刻度，制得供試品溶液.

2.4 多糖溶出率

精密吸取供試品溶液0.6 mL 于具塞試管中，精密吸取0.4 mL 蒸餾水于具塞試管中，立即加入蒽酮試劑4.0 mL，沸水浴中煮沸10 min，冰浴冷卻至室溫，測定吸光度，計算多糖溶出率，其計算公式為，

3 結 果

3.1 葡萄糖標準曲線的制作

精密吸取葡萄糖標準溶液，配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液，在620 nm 波長下測定各試管中溶液的吸光度A.以標準葡萄糖含量(μg)為橫坐標，以吸光度A 為縱坐標，回歸方程為，

y=0.0054x+0.1094，R2=0.9998

結果表明，其在20.52 ～102.6 mg 范圍內呈良好的線性關系，結果如表2 所示.

表2 葡萄糖標準溶液的線性關系

3.2 精密度試驗

精密吸取同一份對照品溶液，按供試品制備方法制備，測定其6 次吸光度A，計算RSD.結果顯示，RSD=3.05%(n=6)，表明方法的精密度良好.

3.3 重復性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，按供試品制備方法制備6 份，測定吸光度A，計算白術藥材多糖溶出率，求得RSD=2.25%(n=6)，表明方法的重現性良好.

3.4 穩定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，按供試品制備方法制備，測定吸光度A，每30 min 測定1 次，連續2 h，求得RSD=1.47%(n=5)，表明方法的穩定性良好.

3.5 加樣回收率

精密量取1 號供試品溶液0.5 mL，6 份，精密加入0.2 mL 標準葡萄糖溶液，0.3 mL 蒸餾水，按供試品制備方法制備，測定吸光度A.結果顯示，加樣回收率平均值為94.57%，RSD=4.75%.

3.6 正交試驗結果

精密吸取1 至9 號白術多糖溶液0.6 mL，按供試品制備方法制備，測定吸光度A，計算白術多糖溶出率.正交試驗結果與顯著性檢驗見表3、表4.

表3 正交試驗結果

表4 顯著性檢驗

從表3 的正交試驗結果可知，由煎煮次數(A)、煎煮時間(B)和煎煮倍數(C)3 組K 值得極差值來分析，各影響因素對多糖提取工藝的貢獻率大小依次為煎煮次數(A)、煎煮倍數(C)、煎煮時間(B).根據多糖溶出率，煎煮次數(A)的最佳水平3，煎煮時間(B)的最佳水平3，煎煮倍數(C)的最佳水平3.從表4 的方差分析結果，因素煎煮時間(B)對實驗結果影響顯著，表明煎煮時間(B)對白術多糖提取工藝影響最強，因素煎煮次數(A)和煎煮倍數(C)對實驗結果影響不顯著，則煎煮次數(A)和煎煮倍數(C)對提取工藝影響一般，各個因素對白術多糖的提取工藝的影響程度為，煎煮時間(B)＞煎煮次數(A)＞煎煮倍數(C)，但從經濟有效的角度出發，本研究選擇A2B3C2為最優化工藝條件，即:提取次數為2 次，提取時間1.5 h，加水量為藥材的10 倍.3.7 驗證試驗

按照最佳提取工藝A2B3C2制備3 批樣品，并測定樣品中白術多糖的含量，其結果見表5.結果表明，在該工藝條件下，白術多糖的溶出率高，工藝穩定.

表5 工藝驗證試驗結果

4 討 論

白術多糖作為白術的重要組成成分，毒性小，生物利用度高，具有明顯的免疫增強作用.目前，白術多糖已用于食品添加劑，以及作為臨床藥物用于恢復期腫瘤病人或化療時輔助應用.為了更好地開發利用白術這一植物資源，本研究采用正交設計的方法對白術多糖的提取工藝進行了研究，得出了提取白術多糖的最佳提取工藝.結果顯示，本提取工藝合理，穩定可行，可為白術多糖的進一步開發利用提供參考.

［1］馬慶華，馬慶華，郭紅艷，等.白術多糖對D-半乳糖致衰大鼠神經細胞抗氧化作用研究［J］.中國老年學雜志，2006，26(12):1658－1600.

［2］張培建，金成，郎潔，等.白術多糖對自體肝移植大鼠缺血再灌注損傷的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2010，30(11):1193－1196.

［3］馮星，邱細敏，黃亞林，等.平江白術多糖對腺嘌呤致大鼠腎衰模型的保護作用［J］.食品科學，2010，31(9):276－278.

［4］汲廣全，陳仁瓊，鄭建仙.白術多糖對樹突狀細胞表型及功能成熟的影響［J］.食品科學，2015，36(3):207－211.

［5］劉麗莎，王銳，旭日花，等.白術多糖對益生菌的促生長作用及結構分析［J］.食品科學，2011，31(19):124－128.

［6］胡微煦，向勤，文珠，等.白術多糖抗神經細胞缺氧性凋亡的機制研究［J］.中國藥理與臨床，2013，29(4):84－88.

［7］鄭禮娟，秦昆明.多指標正交試驗優選白術芍藥散提取工藝［J］.中國中藥雜志，2013，38(10):1504－1509.