基于響應面法優化α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉工藝及建模的研究

高義霞,王淑芳,王丹丹,王廷璞

(天水師范學院生物工程與技術學院,甘肅天水 741001)

基于響應面法優化α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉工藝及建模的研究

高義霞,王淑芳,王丹丹,王廷璞*

(天水師范學院生物工程與技術學院,甘肅天水 741001)

以葡萄糖值(DE)為考察指標,利用單因素實驗和響應面法研究溫度、pH及酶與底物比(E/S)對α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉制糖的影響。應用Lineweaver-Burk和Wilkinson統計法分別求解米氏常數(Km)和最大反應速度(Vm),并建立相應的動力學模型。結果表明:α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉制糖的最佳參數為:pH 6.5,溫度55 ℃及E/S=0.12 U/mg,驗證值為23.103%±0.454%。在30～50 ℃范圍內,Ea=18.977 kJ/moL,ΔH=19.624 kJ/mol。該研究為鷹嘴豆淀粉工業制糖提供理論依據。

鷹嘴豆,酶解,動力學,響應面

鷹嘴豆(CicerarietinumL.),又稱桃豆、雞豌豆等,豆科鷹嘴豆屬植物[1],淀粉含量高達40%～60%[2],具有降血糖、降血脂[3]和抗腫瘤[4]等活性。鷹嘴豆淀粉消化率低、酶解過程與淀粉濃度、pH、溫度、酶類型及離子強度等有關,常規米氏方程難以真實描述反應過程[5],而實際生產中,須明確酶促反應條件及反應動力學特性,以最大化發揮酶催化作用。隨生淀粉酶等新型淀粉酶的出現,直接選擇淀粉顆粒作為底物進行水解成為一種趨勢。

酶促反應動力學是研究酶促反應速度及其影響因素的學科,在酶的結構、功能、作用機制、反應條件及代謝中作用等研究中,具有重要的理論和實踐意義。鐘昔陽[6]利用α-淀粉酶對小麥面粉進行了動力學研究,結果表明,Wilkinson法預測值與實測值基本吻合。張國權[7]利用真菌淀粉酶對蕎麥淀粉進行了動力學研究,并計算了最大反應速度(Vmax)和米氏常數(Km)。張麗華[8]利用響應面法優化蓮藕淀粉酶解工藝,得到最優的酶量、溫度和時間。姜紹通[9]利用響應面法對芋頭淀粉堿性蛋白酶酶解工藝參數進行優化,獲得最優的時間、溫度、pH和酶量工藝參數。

本實驗以溫度、pH及酶與底物比(E/S)為因素,通過響應面法優化α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉制糖的最佳工藝,同時對酶解動力學模型進行研究,為鷹嘴豆淀粉工業制糖提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆 淀粉含量為87%,新疆天山奇豆生物科技有限責任公司;α-淀粉酶(58.7 U/mg) Sigma產品(Lot:STBB0510,來自枯草芽孢桿菌);酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、亞硫酸氫鈉、苯酚、葡萄糖等試劑為國產分析純 購自生工生物工程股份有限公司。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL-20M型高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;PHS-3D型 雷磁pH計:上海精密科學有限公司;722型可見分光光度計 上海欣茂有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鷹嘴豆淀粉的酶解 糖含量測定參考3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[10]。稱取鷹嘴豆淀粉0.1 g,加入20 mL 0.05 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液,攪拌,80 ℃糊化5 min,冷卻至50℃,按E/S=0.01 U/mg加入α-淀粉酶,振蕩混勻,50 min后迅速沸水滅活5 min,測定吸光度,計算葡萄糖值(DE)。

DE(%)=還原糖量(mg)×100/[87%×淀粉量(mg)]

式(1)

式(2)

式中:v為反應速度(mg/(mL·min),m/V為還原糖含量(mg/mL);t為反應時間(min)。

1.2.2 單因素實驗 在溫度50 ℃,pH6.0,E/S 0.04 U/mg條件下,考察時間分別為5、10、20、30、40、50、70,90、110、140、170、200 min時其對DE的影響;在pH6.0,E/S 0.04 U/mg,時間50 min條件下,考察溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時其對DE的影響;在溫度50 ℃,E/S 0.04 U/mg,時間50 min條件下,考察pH分別為4、5、6、7、8時其對DE的影響;在溫度50 ℃、時間50 min、pH7.0條件下,考察E/S分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 U/mg時其對DE的影響。

1.2.3 酶促反應動力學建模 Michaelis和Menten根據快速平衡學說建立米氏方程,Briggs和Haldane用穩態代替快速平衡態,對米氏方程做了修正,得到更合理的酶促反應動力學過程。推導過程簡述如下[11]:

式(3)

式(4)

式(5)

vm=k3E總

式(6)

式(7)

式(8)

式中,k1為ES生成速度;k2、k3分別為ES分解為E+S和P+E的速度;k4為E+P生成ES的速度(反映初期忽略不計)。[S]為底物濃度(mg/mL);E總(U/mL)=[E]+[ES]。利用(8)式求Km和Vm[12]。

1.2.4 酶量對反應速度的影響 在反應時間7 min、pH 7.0、底物濃度20 mg/mL條件下,分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL U/mL酶,測定酶量對反應速度的影響。

1.2.5 響應面法優化酶解工藝 參考李忠海等[13],以pH、溫度及E/S為因子,各因子最優點為基準點,確定適度步長,DE為響應值,利用Design-Expert 8.06軟件設計Box-Benhnken實驗,實驗見表1。在最優工藝條件pH6.5,溫度55 ℃及E/S 0.12 U/mg進行驗證實驗。

表1 Box-Benhnken實驗因素水平及編碼

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

DNS法測定糖含量的標準曲線方程為Y=1.629X-0.042,r=0.997(X為葡萄糖質量,mg,Y為吸光度,A)。

2.2 單因素實驗

時間對DE的影響見圖1,在0～50 min范圍內,隨時間的增加,DE逐漸增大,隨后出現下降,可能是復合糖生成速度逐漸接近、甚至超過淀粉水解速度,即存在較弱的復合反應,故DE的生成將趨于平穩[14],據此,后續研究中時間選擇50 min。

圖1 時間對DE的影響Fig.1 Effect of time on DE

溫度對DE的影響見圖2,在30～50 ℃范圍內,隨溫度升高,酶與底物間碰撞次數增加,DE增加,50 ℃時達最大值,為最適溫度;另一方面,當溫度增至50 ℃以上時,酶逐漸失活,DE下降。

圖2 溫度對DE的影響Fig.2 Effect of temperature on DE

pH對DE的影響見圖3,pH7.0時,DE達到最大值,為最適pH。pH影響酶活性中心必需基團和底物的解離程度,從而影響酶與底物的結合,并最終影響DE的生成[15]。

圖3 pH對DE的影響Fig.3 Effect of pH on DE

E/S對DE的影響見圖4,隨E/S的增加,酶解速度幾乎呈線性增長,原因是反應初期底物過量,酶促反應速度與酶量成正比;隨E/S的進一步增大,底物逐漸不足,反應速度趨于平穩[16]。因此E/S選擇0.1 U/mg。

圖4 E/S對DE的影響Fig.4 Effect of E/S on DE

2.3 響應面分析

Y=-140.651+30.884X1+2.233X2+115.114X3-0.367X1X2-50.268X1X3+3.439X2X3-0.821X12+2.436X22-610.919X32。

Box-Benhnken結果及方差分析見表2和表3,方程具有顯著性(p=0.0263),表明模型顯著。失擬項p=0.213>0.05,失擬不顯著,回歸模型與實際情況擬合較好。pH極顯著,E/S影響顯著,溫度影響不顯著。各因素影響大小依次為pH、E/S及溫度。交互項影響均不顯著。最優工藝為:pH 6.5,溫度55 ℃及E/S 0.12 U/mg。在此條件下進行驗證,結果見表4。

表2 Box-Benhnken實驗設計表及結果

表3 回歸模型系數顯著性檢驗及其方差分析

表4 驗證實驗

驗證實驗平均值為(23.103%±0.454%,n=6),RSD=1.964%,模型有效,可用于鷹嘴豆淀粉酶解參數的優化。酶解效率較低,其原因一方面由于α-淀粉酶首先作用于較容易水解的無定形區,隨后殘留的結晶區將部分地限制其水解[17],另一方面與淀粉分子中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例、顆粒大小、形狀、結晶結構和結晶度等有關[18]。另外,鷹嘴豆中脂類化合物易與直鏈淀粉形成復合物,該復合物對淀粉顆粒的糊化、膨脹和溶解具有較強的抑制作用,對酶水解耐受性強[19]。

2.4 酶量對酶促反應速度的影響

酶量與反應速度的關系見圖5,當底物過量時,酶促反應速度與酶量成正比。時間與反應速度的關系見圖6,在0～7 min時間與反應速度線性較好,測定時間太短,反應速度誤差較大,測定時間太長,則線性程度降低,綜合考慮,確定酶促反應線性測定時間為7 min。

圖5 酶量對酶促反應速度的影響Fig.5 Effect of enzyme concentrationon reaction velocity

圖6 反應時間的確定Fig.6 Determination of reaction time

2.5 Lineweaver-Buck法求解參數

V-S曲線見圖7,以1/V為縱坐標,1/S為橫坐標,見圖8,Y=48.546X+5.054,r=0.992。計算得Vm=0.198 mg/(mL·min),Km=9.605 mg/mL。

圖7 反應速度與底物濃度的關系Fig.7 Relationship of reaction velocityand substrate concentration

圖8 雙倒數作圖Table 8 Double-reciprocal plot

2.6 Wilkinson統計法求解參數

2.6.2 泰勒展開式求精校解 Wilkinson法求得精確解為Vm=0.132 mg/mL·min,Km=5.736 mg/mL。

2.6.3 Lineweaver-Buck法和Wilkinson統計法的比較 由表5可知,Lineweaver-Buck法和Wilkinson統計法計算結果有一定的差別。當淀粉濃度較低時,Lineweaver-Buck法[20]取倒數后誤差較大,偏離直線較遠,且[S]適合范圍一般為在0.33 Km～2Km,因此影響Km和Vm的準確性,但該法方便快速,計算量小[21]。Wilkinson統計法結果可靠[22]。綜合考慮各方面因素,最終采用Wilkinson統計法計算結果,最終得出Vm=0.132 mg/(mL·min),Km=5.736 mg/mL。

表5 Lineweaver-Buck法和Wilkinson統計法數據比較

2.7 Ea及ΔH計算

在30～50 ℃范圍內,反應速度隨溫度的增加而增大,以lnv對1/T(×103)作圖,見圖9,呈直線關系,用阿累尼烏斯(Arrhenius)方程擬合。

式(9)

式中:R為氣體常數8.31{J/(mol·K)};Ea為活化能(kJ/mol);B為積分常數。

K3=A×exp(-Ea/RT)

式(10)

式中,A為指前因子{mg/(mL·min)}。

以lnV為縱坐標,1/T(×103)為橫坐標,Y=4.654-2.284X,r=0.97。求得Ea=18.977 kJ/moL,A=104.962 mg/(mL·min)。

lnKs=-ΔH/RT+lnC

式(11)

K3≥K2,Ks≈Km,以不同溫度下Km與1/T回歸,見圖10,以lnKs為縱坐標,1/T(×103)為橫坐標,Y=7.078-1.76X,r=0.99。求得ΔH=19.624kJ/mol。

圖9 lnv與1/T的關系Fig.9 Relationship between lnv and 1/T

圖10 lnKs與1/T的關系Table 10 Relationship between lnKs and 1/T

3 結論

本實驗結合單因素實驗和響應面法優化α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉的工藝參數,并對酶解動力學進行研究。結果表明:酶解工藝為:pH 6.5,溫度55 ℃和E/S 0.12 U/mg。在此條件下,DE驗證值為23.103%±0.454%,RSD=1.964%。利用Lineweaver-Burk及Wilkinson統計法進行了數學回歸,并分析比較后選擇Wilkinson統計法,求解得動力學參數Km=5.736 mg/mL,Vm=0.132 mg/(mL·min)。在30～50℃范圍內,Ea=18.977 kJ/moL,ΔH=19.624 kJ/mol,該模型推導過程中,各因子影響水解速度的數據擬合,方程相關性高,表明用米氏方程對α-淀粉酶酶解鷹嘴豆淀粉的動力學過程進行描述和模擬式有效的。

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Study on the processing optimization and modelling of enzymolysis for Chickpea starch based on response surface method

GAO Yi-xia,WANG Shu-fang,WANG Dan-dan,WANG Ting-pu*

(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui 741001，China)

Using dextrose equivalent value(DE)as an index,the effect of temperature,pH and the ratio of enzyme to substrate concentration(E/S)on enzymolysis of chickpea starch with α-amylase were explored based on single experiment and response surface method. The Michaelis constant(Km),Maximum velocity(Vm)and corresponding kinetics modeling were also established by Lineweaver-Burk plotting and Wilkinson statistical method,respectively. The results indicated that the optimal parameters were pH6.5,temperature 55 ℃ and E/S value 0.12 U/mg,and the verification value was 23.103%±0.454%. Ea and ΔH were 18.977 kJ/mol and 19.624 kJ/mol in the temperature range of 30 ℃ to 50 ℃,respectively. The study might provide a theory basis for industrial production of sugar from chickpea starch.

Chickpea;enzymolysis;kinetics;response surface method

2014-10-21

高義霞(1982-)，女，碩士研究生，講師，從事食品化學研究，E-mail:egaoxy@yeah.net。

*通訊作者:王廷璞(1965-)，男，研究員，從事食品化學研究，E-mail:15293557513@163.com。

國家自然科學基金(31360603)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)15-0087-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.010