低pH條件下大豆蛋白7S和11S組分的表面特性

徐紅華,董世榮,何雪飛

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

低pH條件下大豆蛋白7S和11S組分的表面特性

徐紅華,董世榮,何雪飛

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

本文采用7S形成纖維聚合結構的制備條件,研究低pH條件下長時間熱處理對大豆蛋白7S和11S(包括酸性亞基和堿性亞基)乳化性和起泡性的影響。結果發現,低pH條件下長時間熱處理的聚合手段,可以顯著(p<0.05)改善不同大豆蛋白組分的起泡性,但對乳化性沒有明顯的改善作用,甚至對乳化穩定性有降低作用,這種改善程度與是否形成纖維聚合結構無關。與pH7.0條件下的熱處理手段相比,低pH條件下長時間熱處理的聚合手段能夠使大豆蛋白7S和11S表面疏水性顯著增加,這種特殊的結構變化更有力于提高起泡性能。因此,在低pH條件下長時間熱處理后,7S和11S具有較高的表面疏水性和較好的起泡性能。

大豆蛋白,起泡性,乳化性,表面疏水性,聚合

與其他植物蛋白相比,大豆蛋白擁有較突出的表面性質,表面性質的改善取決于大豆蛋白分子的組成、形狀、電荷分布、表面疏水性、空間結構、分子的柔性和剛性以及與其他成分的作用或反應等[1],其中,熱聚合是改善蛋白質表面性質非常重要的手段之一。Wang 等人[2]發現在pH2.0條件下85℃加熱7S的三種亞基(α,α′和β)6～20 h可以形成纖維聚合物;Tang等人[3]發現在pH2.0條件下80 ℃長時間加熱7S可以形成纖維聚合物;同時Tang等人[4]研究發現pH 2.0的7S在不同的靜電屏蔽條件下80 ℃加熱也可以形成纖維聚合物。這種獨特的蛋白質聚合結構引起了人們的廣泛關注。本文研究了在低pH(2.0)長時間熱處理條件下形成纖維聚合結構的7S與不能形成纖維結構的11S(包括酸性亞基和堿性亞基)的乳化性和起泡性,比較了與常規pH(7.0)條件下對應表面性能的差異,分析了不同pH條件下蛋白質熱聚合物表面結構特性的變化,以及這種結構差異與界面性質之間的關系,希望為改善大豆蛋白功能性質提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 購自東北農業大學大豆研究中心;自制脫脂豆粉 利用組織搗碎機將大豆磨碎,過60目篩,按照國標G2906-82進行脫脂,樣品自然干燥得到自制脫脂豆粉(蛋白質49.44%,灰分0.0891%),ANS熒光探針,Sigma公司。

DS-1高速組織搗碎機 上海精科實業有限公司;BME100L高剪切混合乳化機 啟東市長江機電有限公司;KDN-102C半自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;F-4500熒光分光光度計 日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 7S和11S的分離 依據Nagano[5]的方法對7S和11S球蛋白進行分離。取一定量的自制脫脂大豆粉與去離子水按照1∶15(w/v)的比例進行充分溶解后調解pH至8.0,然后在室溫下充分攪拌2 h。將溶液離心(9000×g,30 min),取上清液后,用2 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl,將pH調解至6.4,冰浴過夜。然后將溶液離心(6500×g,20 min,4 ℃)得到的沉淀即為11S球蛋白(用去離子水清洗兩遍),收集上清液將pH調至4.8,離心(6500×g,20 min,4 ℃),沉淀為7S球蛋白。將所得的7S和11S球蛋白沉淀溶于去離子水中,調節pH至7.0,充分攪拌直至充分溶解后用去離子水透析48 h。冷凍干燥,即制得7S和11S球蛋白。

1.2.2 酸性亞基和堿性亞基的分離 酸性(Acidic subunits)和堿性亞基(Basic subunits)的分離和制備依據Mo[6]等人的分離方法。將上述分離得到的11S大豆球蛋白用30 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)配成5 mg/mL的溶液,添加10 mmol/L的β-巰基乙醇,然后在90 ℃水浴30 min后冷卻,離心(10000×g,20 min,4 ℃),收集上清液和沉淀。收集的沉淀用去離子清洗兩遍,此沉淀即為堿性亞基。將上清液調節pH至5.0,然后再離心(6500×g,20 min,4 ℃),沉淀用去離子水清洗兩遍,即為酸性亞基。

1.2.3 熱聚合物的制備 參考Wang等人[2]關于7S纖維聚合物的制備方法,分別將一定量的7S、11S、酸性亞基和堿性亞基溶于去離子水中,將溶液pH調至2.0(2 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl),對照樣pH調至7.0,然后在15000 g離心20 min(20 ℃),取中間清液,根據凱氏定氮測定的中間清液蛋白質含量結果,用去離子水調整蛋白質濃度至10 mg/mL,然后將溶液的pH精確調至2.0(對照樣調至7.0),95 ℃水浴加熱20 h,每隔2 h取樣立即冷卻,后立即冷卻,4 ℃冰箱保存過夜。

1.2.4 表面疏水性的測定 利用ANS熒光探針法可以測定大豆蛋白表面疏水性的方法,在此基礎上進行一定的修飾[7]。pH7.0或pH2.0、濃度為10 mg/mL的7S、11S、酸性亞基和堿性亞基溶液,在95 ℃分別加熱20 h,每隔2 h取樣,作為樣品。然后用0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)分別將加熱后的樣品溶液稀釋成蛋白濃度0.1、0.05、0.0025、0.00125 mg/mL等一系列樣品,然后加入20 μL的ANS(8 mmol/L,溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖液,pH7.0)熒光探針,混勻后在室溫下避光15 min,激發波長390 nm,發射波長470 nm以及狹縫5 nm的條件下,在熒光分光光度計下比色測得的熒光強度對蛋白溶液濃度作圖,選擇線性關系良好的回歸線的斜率作為蛋白質表面的疏水性指數。

1.2.5 起泡性的測定 參考Motoi[8]等人測定蛋白質溶液的起泡能力(FC)和泡沫穩定性(FS)的方法進行如下實驗。pH7.0或pH2.0、濃度為10 mg/mL的7S、11S、酸性亞基和堿性亞基溶液,在95 ℃分別加熱0 h和20 h,然后用0.01 mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液稀釋至1 mg/mL,室溫下用組織搗碎機12000 r/min均質1 min,立即轉移至500 mL的量筒中測定攪打后大豆蛋白質樣品泡沫的體積,再測定放置30 min后泡沫的體積,通過泡沫體積和靜止后穩定的泡沫體積的比來計算樣品的起泡能力(FC)和泡沫穩定性(FS),具體計算方法如下:

起泡能力(%)=V0/Vi×100

泡沫穩定性(%)=Vt/V0×100

式中:V0-起泡0 min時的泡沫體積,Vt-起泡t min后的泡沫體積,Vi-起泡前最初液體的體積。

1.2.6 乳化性的測定 蛋白質溶液乳化性能的測量采用Pearc[9]等人的方法。pH7.0或pH2.0、濃度為10 mg/mL的7S、11S、酸性亞基和堿性亞基溶液,在95 ℃分別加熱0 h和20 h,然后分別取3 mL加入1 mL的大豆油,混合液在20000 r/min均質2 min,乳化液靜止0 min和10 min,然后立即從乳化液中取10 μL加入5 mL的1 mg/mL的SDS中,混勻,在500 nm處測定吸光值,以1 mg/mL的SDS為空白調零。乳化活性(EAI)和乳化穩定(ESI)計算公式如下[10]:

EAI(m2/g)=((2×2.303)/(C×(1-φ)×104))×A500×D

ESI(%)=100×At/A0

式中:2.303-乳化活性計算常數;A500-溶液在500 nm下的吸光值,可用平均值計算,C-蛋白質濃度(g/mL),D-稀釋倍數,φ-大豆油占乳化液的體積分數(φ=0.25),At-乳化液靜止時間為t min時的吸光值,A0-乳化液靜止時間為0 min時的吸光值。

1.2.7 數據分析 實驗數據采用excel和Statisix8.1軟件對實驗數據進行統計分析。數據均以平均值±標準差表示(n=3)。

2 結果與分析

2.1 起泡性

2.1.1 低pH下大豆蛋白組分起泡性的比較 從結果中可以看出,依據7S形成纖維結構的處理條件,4種大豆蛋白組分在pH2.0的條件下長時間加熱,起泡性均有一定程度的提高,但是提高的幅度不同(p<0.05),其中7S、11S、酸性亞基和堿性亞基起泡能力的提高幅度分別為132.32%、122.54%、140.83%和48.76%(圖1a);同時,泡沫穩定性提高的幅度分別為61.69%、50.35%、35.55%和29.01%(見圖1b)。這種改善與是否能夠形成纖維聚合物無關,因為Tang[3]等人研究發現7S較11S具有更強的纖維化能力,因此,對于形成纖維聚合物的7S和不能形成纖維結構的11S,以及由11S解離出來的酸性亞基和堿性亞基均有很大程度的改善。說明低pH條件下長時間加熱的處理手段可以顯著改善4種大豆蛋白組分的起泡性。具有良好起泡性能的蛋白具有的特征之一是通過分子相互作用形成黏性膜[1],而Akkermans等人發現在低pH下加熱形成的纖維聚合物使得黏度增加[11],這些可以解釋在低pH下加熱4種大豆蛋白可以改善其起泡性。

圖1 低pH條件下4種大豆蛋白組分熱處理前后起泡性的差異Fig.1 The foaming properties offour soy protein components at low pH注:同一圖上字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 不同pH下起泡性的差異 從圖2的實驗結果可以發現,無論是形成纖維聚合結構的7S還是不能形成纖維結構的11S,在加熱20 h后,pH2.0條件下7S和11S的起泡能力顯著(p<0.05)高于pH7.0條件下的起泡能力。7S和11S在pH2.0條件下形成的聚合物的起泡能力分別是pH7.0條件下形成聚合物的起泡能力的2.37倍和6.32倍;7S和11S泡沫穩定性分別是pH7.0條件下的1.79倍和4.16倍。說明低pH條件下7S和11S形成的熱聚物結構更有利于改善其起泡性,這種聚合結構不僅僅局限于纖維結構。Martinez等人[12]研究發現在糖基化的酪蛋白和明膠混合體系中pH3.5和pH6.5條件形成不同的復合體使得其起泡性存在不同。因此,7S和11S在不同pH下具有不同的起泡性,可能也是因為兩者在不同pH下形成的聚合物結構不同。

圖2 不同pH下7S和11S起泡性的差異Fig.2 The foaming properties ofsoy protein 7S and 11S at different pH

2.2 乳化性

與起泡性的結果不同,低pH的處理手段并沒有對7S和11S的乳化性存在一致的改善作用。與pH7.0的結果相比,在pH2.0條件下7S形成的纖維聚合結構降低了乳化活性,同時也降低了乳化穩定性;11S在低pH條件下熱聚合的非纖維聚合結構提高了其乳化活性,但是,熱處理前后的乳化穩定性顯著(p<0.05)降低,降低幅度明顯高于pH7.0的結果(圖3)。如果將11S解離為酸性亞基和堿性亞基,堿性亞基乳化活性有所提高(p<0.05),但酸性亞基變化不明顯(p>0.05),對于乳化穩定性而言,與11S不同,酸性亞基和堿性亞基相對熱處理之前均有明顯提高(圖4)?？傊?低pH的處理手段對7S和11S(包括酸性亞基和堿性亞基)乳化性并沒有一致的改善作用。王金梅等人[13]發現在低pH(酸性)條件下長時間加熱大豆蛋白可以不同程度的增加其界面活性,但是其形成的纖維聚合物對其乳化液的性質和穩定性并沒有明顯的改善。

圖3 不同pH下7S和11S乳化性Fig.3 The emulsifying properties ofsoy protein 7S and 11S at different pH

2.3 表面疏水性

從實驗結果可以看出,在加熱過程中,pH7.0條件下的7S和11S的表面疏水性明顯低于pH2.0條件下的7S和11S的表面疏水性(圖5)。不同pH下7S和11S蛋白質表面疏水性的變化與其起泡性能和乳化性能有著密切的關系,低pH條件下熱處理2 h后7S和11S蛋白質分子表面疏水性最高,有更多的疏水氨基酸殘基暴露,隨后表面疏水性雖有一定降低,但是,依然顯著高于pH7.0時7S和11S的熱聚合變化,這種蛋白質結構的變化結果使7S和11S的起泡性顯著(p<0.05)改善,特別是起泡能力有大幅度提升,而疏水性的這種變化對乳化活性的改善不顯著(p>0.05)(表1)。乳化性的結果與Zhang等人[14]發現的在不同pH下乳化活性和表面疏水性是相互獨立的結果一致。

表1 不同pH下7S和11S加熱后起泡性和表面疏水性的關系

圖4 4種原料在pH2.0條件下的乳化性Fig.4 The emulsifying properties offour soy proteincomponents at pH2.0

圖5 不同pH下7S和11S加熱過程中的表面疏水性Fig.5 The surface hydrophobicity ofsoy protein 7S and 11S at different pH

注:
注:同列字母不同者差異顯著(p<0.05)。

3 結論

低pH條件下長時間熱處理的聚合手段,可以顯著改善大豆蛋白7S和11S(包括酸性亞基和堿性亞基)的起泡性,對乳化性的影響不顯著,這種改善與是否形成纖維聚合結構無關。低pH條件下長時間熱處理與pH7.0條件下的熱處理手段相比,能夠使大豆蛋白7S和11S表面疏水性顯著增加,這種結構的變化結果更有力于提高起泡性能。

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Superficial properties of soy protein 7S and 11S at low pH

XU Hong-hua,DONG Shi-rong,HE Xue-fei

(College of Food,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Based on the conditions of 7S forming fibril,the emulsifying and foaming properties of soy protein 7S and 11S(including acidic and basic subunits)was investigated under prolonged heat treatment at low pH. The results showed that the foaming properties of different soy protein components were significantly improved(p<0.05),while the emulsification was not sigificantly regular changed even the emulsion stability was reduced by heating treatment at low pH. There were no relationships between the fibrillar aggregates and modified properties. Compared with the heating treatment at pH7.0,the surface hydrophobicities of soy protein 7S and 11S were significantly increased under heating treatment at low pH,and the special structure with high surface hydrophobicities was benefit for improving foaming properties of soy protein. Then,the surface hydrophobicities and foaming properties of 7S and 11S were improved significantly after prolonged heat treatment at low pH.

soy protein;foaming properties;emulsifying properties;surface hydrophobicity;aggregation

2014-10-21

徐紅華(1969-),女,博士,教授,從事食品蛋白質及營養的教學和研究，E-mail:dongshirong118@126.com。

國家自然基金項目(31471682)；黑龍江省教育廳青年學術骨干項目(1155G10)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)15-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.011