不同提取方法對紅芪多糖體外抗氧化活性的影響研究

寇 寧,李磊強,李 欽,程衛東,2,*

(1.蘭州大學基礎醫學院,甘肅蘭州 730000;2.南方醫科大學中醫藥學院,廣東廣州 510515)

不同提取方法對紅芪多糖體外抗氧化活性的影響研究

寇 寧1,李磊強1,李 欽1,程衛東1,2,*

(1.蘭州大學基礎醫學院,甘肅蘭州 730000;2.南方醫科大學中醫藥學院,廣東廣州 510515)

紅芪多糖(HPS)是中藥紅芪中的主要成分。本文分別采用微波輔助、超聲輔助及常規熱水浸提從紅芪中提取HPS,經脫蛋白、冷凍干燥后得到三種方法提取的紅芪多糖HPS-M、HPS-C和HPS-H。紅外光譜分析表明,HPS-M、HPS-C、HPS-H具有多糖的特征吸收峰;GPC測定結果顯示,HPS-M、HPS-C、HPS-H的重均分子量分別為6.29×105、4.56×105、5.13×105,多分散性分別為3.42、3.22、2.31。HPS-H、HPS-M、HPS-C清除羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基及還原力測定的體外抗氧化活性實驗表明,HPS-M的體外抗氧化活性要顯著高于HPS-C、HPS-H,因此,未來可考慮微波輔助法作為紅芪多糖提取的首選方法。

紅芪,多糖,體外抗氧化活性

紅芪為豆科植物多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)的干燥根,具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[1]。紅芪多糖(HPS)是紅芪的主要活性成分之一,是一種由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖[2],作為中醫常用傳統藥物在惡性腫瘤及各種退行性疾病的臨床治療與康復中用量較大[1]。李曉東等人的研究發現,HPS-3能降低血糖,對T2DM大鼠的糖脂代謝紊亂有一定的調節作用,能促進T2DM大鼠肝糖原的合成,修復受損的胰島β細胞,減輕T2DM大鼠胰島素抵抗[3]。衛東峰等人利用蛋白質組學技術,研究了HPS對S180瘤細胞化療協同增效作用的差異蛋白質,發現了對S180小鼠瘤細胞化療增效作用的靶標蛋白,而這些蛋白質涉及能量代謝、氧化應激反應和凋亡信號[4]。楊濤等人采用細胞溶血法對HPS的抗補體活性進行研究結果表明,HPS具有一定程度的抗補體活性[5]。魏舒暢等人利用酶解提取紅芪總多糖的研究發現,酶用量、酶解時間、酶解溫度、溶劑pH、溶劑用量、提取時間等參數的選擇會影響活性成分的提取[6]。

綜上所述,對于HPS活性的研究,主要集中在降血糖、抗腫瘤等生物學活性方面,而多糖生物學活性與其清除自由基的能力密切相關。研究表明,不同的提取方法會影響多糖的清除自由基的活性,但對于不同方法提取的HPS的體外抗氧化活性的研究尚無文獻報道。

本文以紅芪為原料,分別采用微波輔助、超聲輔助與常規熱水浸提提取HPS,并研究不同提取方法HPS的體外抗氧化活性,從而篩選出獲得體外抗氧化活性高的多糖的提取方法,以便為后續的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅芪藥材購自甘肅武都。

電子天平BL320H 北京賽多利斯天平有限公司;紫外可見分光光度計UV1000 北京萊伯泰科儀器有限公司;集熱式恒溫磁力攪拌器DF-101B 科瑞儀器有限公司;冷凍干燥機LGJ-18S 鄭州長城科工貿有限公司;傅立葉紅外光譜儀 Nicolet380 美國熱電;Agilent GPC 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPS的提取 紅芪干燥根經預處理后,根據前期實驗結果[7],采用超聲輔助、微波輔助和常規熱水浸提法對其多糖進行提取,得到HPS-C、HPS-M、HPS-H,具體工藝如圖1所示。

圖1 紅芪多糖的提取工藝流程Fig.1 The extracting processes of HPS fromHedysarum polybotrys Hand.-Mazz

1.2.2 紅外光譜表征(FT-IR) 充分干燥的樣品與KBr壓片,用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內掃描,掃描次數16次,分辨率4 cm-1。

1.2.3 分子量測定 采用體積排阻色譜(GPC)測定分子量。紅芪多糖樣品用去離子水配成所需濃度的溶液,用微孔濾膜過濾,在690 nm波長下用GPC測定。進樣量200 μL,流速為0.5 mL/min,溫度為25 ℃。

式(1)

1.2.5 對羥自由基(·OH)的清除作用 精確稱取一定量的抗壞血酸(VC)與多糖樣品,用蒸餾水配制成濃度為0.04、0.06、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、3 mg/mL的溶液,充分搖勻,備用。分別量取不同濃度的多糖溶液、VC溶液各0.1 mL,依次加入反應液(20 mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液,2.67 mmol/L脫氧核糖,100 mmol/L EDTA)0.6 mL、0.4 mmol/L的硫酸亞鐵胺溶液0.2 mL、10 mmol/L過氧化氫溶液0.2 mL,在37 ℃水浴加熱15 min,再分別加入1%丙二酰硫脲溶液和2%的三氯乙酸溶液各1 mL,終止反應,然后沸水浴加熱15 mim后冷卻至室溫,以蒸餾水為空白調零,在532 nm下測定吸光值,得Ai,用蒸餾水代替樣品,測定A0,根據以下公式計算羥自由基(·OH)清除率[7-10],每個樣品重復三次,求平均值。

式(2)

式(3)

1.2.7 還原力 精確稱取一定量的抗壞血酸(VC),用蒸餾水配制成濃度為0.04、0.06、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、3 mg/mL的溶液,充分搖勻,作為對照品備用。分別量取不同濃度的多糖溶液、VC溶液各1 mL,依次加入磷酸緩沖液(pH6.6)和鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液(1 wt%)各2.5 mL,混勻后50 ℃水浴20 min,然后加入三氯乙酸溶液(10 wt%)2.5 mL,混勻,1000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,再加入蒸餾水和氯化鐵(FeCl3,0.1 wt%)各2.5 mL,混勻,靜置10 min,蒸餾水調零,在700 nm處測定吸光值,每個樣品重復三次,以700 nm吸光值的平均數表示還原力的高低[7,9]。

1.3 數據處理

實驗數據用SPSS 13.0軟件進行統計學分析處理,組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),各組間比較采用雙尾t-檢驗,結果以Mean±SD表示,p<0.05表示差異顯著,p<0.01為差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 HPS的紅外光譜

圖2為不同方法提取的紅芪多糖的紅外光譜圖。從圖2可以看出,三種方法得到的紅芪多糖在3418 cm-1有較強吸收峰,為O-H伸縮振動;2935 cm-1是由C-H伸縮振動引起的;1618 cm-1附近的吸收峰是由COO-基團的C=O非對稱伸縮振動引起的;在1083 cm-1出現的強吸收峰是由糖環中C-O-C的伸縮振動引起的。

圖2 紅芪多糖的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectroscopy of HPS

2.2 HPS的分子量

HPS分子量的GPC色譜圖如圖3所示。由圖3可以看出,HPS的色譜圖的峰比較單一,表明HPS的組分沒有聚集。GPC測定的HPS-M、HPS-C、HPS-H重均分子量為6.29×105、4.56×105、5.13×105,多分散性分別為3.42、3.22、2.31。這主要是由于微波輻射導致紅芪多糖分子的交聯,造成微波輔助提取后多糖分子量增大;超聲振動會導致分子量斷裂,導致超聲輔助提取的紅芪多糖的分子減小。

圖3 紅芪多糖的GPC圖譜Fig.3 GPC chromatograms ofsamples Laser light scattering photometry for HPS

2.3 HPS的體外抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基是一種有機氮自由基,在517 nm處有吸光值,會隨著還原而逐漸的褪色。不同提取方法對HPS清除DPPH自由基的影響如圖4。由圖4可知,0.04～2 mg/mL的濃度范圍內,HPS-M、HPS-C、HPS-H對DPPH自由基的清除率隨濃度的升高而增大,并呈劑量依賴;當HPS的濃度高于2 mg/mL時,這種趨勢不再明顯。HPS-M、HPS-C、HPS-H對DPPH自由基的EC50分別為0.52、0.63、0.72 mg/mL。HPS-M與HPS-C、HPS-H之間差異顯著(p<0.05),HPS-C與HPS-H之間差異不顯著。從圖4可以看出,HPS濃度較高時對DPPH自由基的清除率沒有顯著增強,這可能主要是由于多糖的溶解度的限制以及氫鍵的增加所造成的。

圖4 不同提取方法對HPS清除DPPH·能力影響Fig.4 The DPPH radical scavenging activityof HPS at different extraction methods

2.3.2 對羥自由基(·OH)的清除作用 超聲、微波、熱水三種提取方法對紅芪多糖HPS清除羥自由基(·OH)的影響如圖5所示。羥自由基是體內產生的一種時間短、活性高的自由基,對有機體來說危害非常大,除超氧自由基外,羥自由基被認為是與活細胞中所有功能性生物大分子反應最有效的氧化劑[11-12]。由圖5可知,當HPS的濃度在0.04～1.0 mg/mL時,HPS對羥自由基的清除能力呈劑量依賴關系,隨濃度的增大而增強;當濃度超過1 mg/mL時,紅芪多糖對羥自由基的清除能力隨濃度的增大趨勢逐漸減緩,達到平衡。HPS-M、HPS-C、HPS-H的半數清除濃度(EC50)分別為0.55、0.67、1.42 mg/mL。HPS-C和HPS-M對羥自由基的清除能力要明顯高于HPS-H,且差異顯著(p<0.05),其中微波提取的HPS-M對羥自由基的清除活性最高,但三種方法得到HPS清除羥自由基的能力均低于維生素C的清除能力。

圖5 不同提取方法對HPS清除·OH能力影響Fig.5 The ·OH radical scavenging activityof HPS at different extraction methods

圖6 不同提取方法對HPS 清除·能力影響Fig.6 The · radical scavenging activityof HPS at different extraction methods

2.3.4 還原力 多糖的還原能力主要是通過多糖存在時Fe3+-Fe2+的轉化所測定的。多糖的還原能力,是多糖所具有的抗氧化活性的重要指標之一。不同處理方法對紅芪多糖HPS還原力的影響如圖7。由圖7可知,在實驗濃度范圍內,HPS-M、HPS-C、HPS-H的還原力隨濃度的增加而增強。在濃度為0.4 mg/mL之前,HPS-M、HPS-C、HPS-H的還原力增強趨勢不明顯,在0.4 mg/mL之后,隨著HPS濃度的增大,還原力明顯增強,由此可知,HPS的還原力很大程度上依賴于濃度,濃度增大其活性基團的濃度也隨之增加,相應地還原力隨之增強。在濃度為0.04～0.2 mg/mL時,HPS-M、HPS-C、HPS-H的差異不顯著,0.4 mg/mL時,HPS-M與HPS-C、HPS-H的差異都顯著(p<0.05)。

圖7 不同提取方法對HPS還原能力影響Fig.7 The reducing power of HPSat different extraction methods

3 結論

3.1 紅外光譜分析表明,三種方法得到的HPS-M、HPS-C、HPS-H在3418、2935、1618、1083 cm-1都有吸收峰,此為多糖特征吸收峰,表明HPS-M、HPS-C、HPS-H均為多糖;GPC測定結果顯示,HPS-M、HPS-C、HPS-H重均分子量分別為6.29×105、4.56×105、5.13×105,表明微波、超聲均會對多糖的分子量產生影響。

3.2 體外抗氧化活性測定實驗表明,HPS-M、HPS-C、HPS-H清除羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基的能力依次減小,且HPS-M的體外抗氧化活性要遠高于HPS-C、HPS-H。多糖清除羥自由基、DPPH自由基、超氧自由基以及其還原力會影響到紅芪多糖的調節血糖、抗腫瘤等方面的生物學活性,因此,出于對紅芪多糖生物學活性的考慮與提取效率的考慮,未來可選擇微波輔助法作為紅芪多糖的提取方法。

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Study on anti-oxidant activity of polysaccharides fromHedysarumpolybotrysHand.-Mazz. by different extraction methodinvitro

KOU Ning1,LI Lei-qiang1,LI Qin1,CHENG Wei-dong1,2,*

(1.College of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.College of Chinese Medicine,Southern Medical University,Guanzhou 510515,China)

Polysaccharides were one of the main components ofHedysarumpolybotrysHand.-Mazz(HPS). In this paper,the antioxidant activity of polysaccharides fromHedysarumpolybotrysHand.-Mazz with microwave-assisted extraction,ultrasonic assisted extraction and hot water extraction methods was investigated. HSP-M,HSP-C and HSP-H after deproteinization and vacuum freeze-drying were characterized by FT-IR and measured by GPC. The result indicated that HSP-M,HSP-C and HSP-H had typical absorption peak of polysaccharides,weight average molar mass(MW)were 6.29×105,4.56×105,5.13×105and polydispersion and gyroradius determined were 3.42,3.22,2.31. Anti-oxidant effect on scavenging DPPH radicals,OH radicals and superoxide radicals and reducing power on HSP-M,HSP-C and HSP-H were measured. The resualts showed that anti-oxidant effect of HSP-M was higher than HSP-C and HSP-H. To get practical methods for the research and manufacture of HPS,microwave-assisted extraction method should be chosen.

HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.;polysaccharides;anti-oxidant activityinvitro

2014-11-13

寇寧(1977-)，女，碩士研究生，講師，研究方向：中西醫結合治療常見病，E-mail:kouning1123@163.com。

*通訊作者:程衛東(1961-)，男，博士，教授，研究方向：中西醫結合治療常見病，E-mail:chengweidong888@sina.com。

基于不同君藥——紅芪替換經典復方中黃芪免疫衰老機制比較研究(81373806)；用紅芪與用黃芪玉屏風散的抗免疫老化機制比較研究(GZK-2012-43)；基于蛋白質組學探討紅芪多糖延緩免疫衰老機制(GZK-2013-18)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)15-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.013