幾株乳酸菌對干紅葡萄酒揮發性成分的影響

周安玲,米 蘭,李霽昕,蔣玉梅

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

幾株乳酸菌對干紅葡萄酒揮發性成分的影響

周安玲,米 蘭,李霽昕,蔣玉梅*

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

以完成酒精發酵的干紅葡萄酒為原料,選用實驗篩選的4株乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發酵(Malolactic fermentation,MLF),以未進行MLF的試樣為對照,采用頂空固相微萃取、氣相色譜-質譜(HS-SPME-GC/MS)聯用技術分析試樣揮發性組分。結果顯示,4個試樣中共檢出70種揮發性組分,其中酒樣C5檢出42種,N8檢出46種,N9檢出46種,N13檢出48種。CK檢出35種,MLF試樣揮發性物質種類及揮發量均較對照多,表明MLF過程中有新的揮發性組分形成,對葡萄酒香氣品質有修飾作用。4種乳酸菌中,篩自泡菜的C5菌株(Lactobacillus plantarum)用于MLF后酒樣酯類組分最高,相對含量達56.48%,酸類最低,占1.23%,酒樣揮發性組分構成優于其它菌株。

乳酸菌,揮發性化合物,蘋果酸-乳酸發酵,頂空固相微萃取,氣相色譜-質譜聯用

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料,經過部分或全部發酵釀制而成,具有一定酒精度的發酵產品。香氣是評價葡萄酒品質最為重要的指標之一[1],葡萄酒的釀造過程酵母菌、乳酸菌等微生物代謝使得葡萄酒產品香氣表現得復雜和多樣[2]。目前已從葡萄酒中分離鑒定出約有800多種揮發性成分,主要包括醇、酯、有機酸、揮發性酚、內酯、縮醛、芳香酮、萜烯類、脂肪酸、單萜醇氧化物等[3-5],共同作用形成了葡萄酒產品獨特的香氣風格和特色。

蘋果酸乳酸發酵(Malolactic fermentation,MLF)是葡萄酒在乳酸細菌作用下將蘋果酸分解成乳酸和二氧化碳的過程,具有生物降酸、增加葡萄酒中微生物穩定性和改善葡萄酒香氣,降低粗糙感,使之柔和、圓潤的作用。對提高葡萄酒的感官質量,改善葡萄酒風味有重要影響。

國內外對于葡萄及葡萄酒揮發性組分進行了大量的研究,但大多主要集中在葡萄酒中揮發性組分分類、感官閾值分析[6-7]、合成途徑與代謝機理研究[8],及葡萄酒揮發性組分釋放影響因素的研究[9-12]。關于MLF對葡萄酒揮發性組分的影響研究目前鮮見報道,Henick-Kling T認為MLF可以改變葡萄酒中的水果香氣,產生新的活性香氣成分,從而影響了原有的香氣平衡[13]。能進行葡萄酒乳酸發酵的細菌是乳酸菌的一些特殊的種,主要分屬于酒球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)等,不同種的蘋果酸-乳酸菌釀酒特性不同,但目前不同乳酸菌MLF對香氣成分的影響研究較少。

本實驗以酒精發酵結束后的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龍珠(Cabernet Gernischet)、品麗珠(Cabernet franc)釀造的混合干紅葡萄酒為原料,選用實驗篩選的4株乳酸菌(菌株編號分別為C5(Lactobacillusplantarum)、N8、N9、N13(LactobacillusBeijerinck)分別對其進行蘋果酸乳酸發酵(Malolactic fermentation,MLF),以未進行蘋果酸乳酸發酵的試樣為對照,采用頂空固相微萃取、氣相色譜-質譜(HS-SPME-GC/MS)聯用技術,分析4種不同菌株MLF后,葡萄酒香氣構成的變化,比較所篩菌中對葡萄酒香氣品質的影響確定與葡萄酒香氣品質呈正相關的菌種,為葡萄酒MLF專用優良乳酸菌菌株篩選及葡萄酒生產提供科學數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龍珠(Cabernet Gernischet)、品麗珠(Cabernet Franc)葡萄 2013年10月采于甘肅農業大學葡萄園;商品釀酒酵母:紅佳釀Vintage Red(VR) 意大利Enartis公司;乳酸菌:C5 篩選自泡菜的植物乳桿菌株(Lactobacillus plantarum);N8、N9、N13 篩選自酸奶中的乳桿菌(Lactobacillus Beijerinck);果膠酶(Ex.color) 酶活力40000UPTE/mL,法國Lallemand公司。

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸氣滅菌鍋 上海中安醫療器械廠;SPX-150-Ⅱ生化培養箱 上海躍進醫療器械有限公司;SSW-CJ-1FD凈化工作臺 上海躍進醫療器械有限公司;CP214型電子天平 奧豪斯儀器有限公司制造;HH-S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器制造有限公司;氣相色譜-質譜聯用儀(GC型號TRACE 1310,MS型號ISQ) Thermo Scientific,USA;頂空固相微萃取器(DVB/Carboxen/PDMS(50/30 μm) SUPELCO,USA;色譜柱DB-WAXETR 60 m×0.25 mm×0.25 μm,thermo,USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 酒精發酵:參照干紅葡萄酒的一般生產工藝流程釀造[14],赤霞珠、蛇龍珠、品麗珠除梗破碎按比例10∶33∶16混合,裝入10 L的棕色瓶,添加120 mg/L偏重亞硫酸鉀和20 mg/L果膠酶浸漬24 h,加入0.2 g/L活化好的紅佳釀酵母25 ℃發酵發酵7 d,殘糖<4 g/L,完成酒精發酵。

MLF:紗布過濾進行皮渣分離制得原料酒樣分裝到15個250 mL的棕色瓶中,接入實驗選用4株乳酸菌,每株菌做3個平行實驗,乳酸菌參照文獻[15]活化,接種量約為1×107CFU/mL。于生化培養箱20 ℃發酵,每隔2 d以紙層析方法檢測蘋果酸、乳酸[16]。發酵12～18 d后MLF結束。酒樣品分別以菌株標號C5、N8、N9、N13表示,以未進行乳酸發酵樣品為對照(CK)。

供試樣品常規理化指標:還原糖、酒精度、FSO2和TSO2含量、干浸出物含量、滴定酸含量、pH和揮發酸含量等,檢測結果均符合國家葡萄酒產品標準(GB15037-2006)。

1.2.2 揮發性成分提取 準確量取實驗樣品5 mL于樣品頂空瓶中,加1.00 g NaCl和磁力攪拌子密封,250 ℃下老化1 h的固相微萃取頭于40 ℃下頂空吸附30 min,萃取結束插入GC-MS進樣口,250 ℃解析10 min進樣分析。

1.2.3 GC-MS條件分析 色譜條件:進樣口溫度230 ℃;載氣為He;流速1 mL/min;不分流進樣,15 min后打開分流閥,分流比20∶1;程序升溫:初溫60 ℃,2 ℃/min至170 ℃,5 ℃/min至230 ℃(10 min)。

質譜條件:連接桿溫度230 ℃;離子源為EI源(70 eV),離子源溫度:250 ℃,質量掃描范圍50～450 m/z。

1.2.4 數據處理 相對含量:峰面積歸一化法,扣除峰面積小于100或無法定性的雜質峰計算總峰面積,組分相對含量(%)=各物質離子流圖峰面積/總峰面積×100。

定性分析:由GC-MS分析得到的質譜數據參考文獻資料[17-19]經計算機檢索NIST2011、Wiley及香精香料標準譜庫對分離揮發性物質進行初步定性。

2 結果與分析

2.1 樣品揮發性物質初步定性分析

固相微萃取結合GC-MS技術分析試樣及對照揮發性成分顯示,MLF試樣及對照試樣揮發性物質的出峰時間主要集中在5 min到75 min(圖1～圖5)。

圖1 C5乳酸菌蘋乳發酵試樣總離子流圖Fig.1 Total iron chromatograms of C5 sample

圖2 N8乳酸菌蘋乳發酵試樣總離子流圖Fig.2 Total iron chromatograms of N8 sample

圖3 N9乳酸菌蘋乳發酵試樣總離子流圖Fig.3 Total iron chromatograms of N9 sample

圖4 N13乳酸菌蘋乳發酵試樣總離子流圖Fig.4 Total iron chromatograms of N13 sample

圖5 CK總離子流圖Fig.5 Total iron chromatograms of CK sample

MLF試樣中共初步分離定性出70種揮發性成分(表1),其中C5酒樣檢出42種,N8酒樣檢出46種,N9酒樣檢出46種,N13酒樣檢出48種,對照酒樣檢出35種。由此可見MLF可豐富葡萄酒的揮發性物質的種類。這些化合物中,高級醇和酯是兩類最主要的揮發性組分,其中酯類25種,醇類25種,酸類6種,萜烯類6種,其他物質8種。5種試樣共有的組分18種,醇類、酯類各占一半,MLF試樣共有的組分有25種,和對照試樣相比新增醇類3種,酯類2種,其他2種,且MLF試樣醇類、酯類相對含量發生變化。由此可見篩選出的乳酸菌進行MLF后對葡萄酒揮發性物質的種類及相對含量均有影響。

2.2 醇類成分比較

試樣醇類物質比較分析可知,C5、N8、N9、N13及對照試樣中總醇類的相對含量分別為39.35%、54.99%、67.20%、56.22%、30.82%,醇類個數分別為18、19、21、20、11。MLF試樣中醇類物質種類及相對含量均高于對照(圖6)。可見,MLF可以增加葡萄酒的醇類物質種類及促進醇類物質的釋放。

圖6 不同來源乳酸菌株MLF后與對照酒樣醇類比較Fig.6 Comparison of alcohols indifferent MLF wine samples with control

5種試樣中共有的醇類組分8種,其中1-戊醇和苯乙醇的相對含量都顯著高于其他醇類。具有酒香、果香的1-戊醇在C5酒樣中相對含量最低,僅為對照的85%,在N13酒樣中相對含量最高,為對照的2倍。具有花香的苯乙醇在對照試樣中相對含量最低,是9.38%,MLF試樣中均有所增加,N8酒樣增加最多,為對照的2.5倍。葡萄酒中的高級醇主要是由氨基酸或己糖通過丙酮酸途徑生產的[13],乳酸菌菌株來源、菌屬及菌株個體存在差異,菌株代謝過程及酶活不同,最終導致代謝產物及次級代謝產物不同。

MLF試樣中共有醇類組分11種,較對照新增醇類物質包括葉醇、芳樟醇、苯甲醇。這些醇類的相對含量均較小,感官表現為青香、花香和果香,對葡萄酒香氣品質有一定修飾作用。MLF試樣中苯乙醇和正己醇的相對含量增加,這與張軍翔2006年研究的結果MLF葡萄酒中苯乙醇的含量減少不符[23],可能是發酵菌株不同造成的。

2.3 酯類成分比較

樣品中酯類物質比較顯示,C5、N8、N9、N13及對照試樣中總酯類物質相對含量分別為56.48%、37.20%、25.44%、35.24%、61.30%。MLF試樣酯類物質相對含量均低于對照試樣(圖7)。MLF試樣的酯類個數和對照接近,但種類存在較大差異。C5酒樣酯類相對含量略低于對照,N9酒樣相對含量最低,為對照的42%,N8酒樣和N13酒樣的酯類相對含量相差不大,約為對照的一半。

5種試樣共有的酯類組分8種,分別為乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯。MLF試樣中均新增酯類有2種,分別是正己酸乙酯、棕櫚酸乙酯,這些新增酯類感官表現為酯香、果香及奶油香,使葡萄酒香氣更豐富。酯類物質是葡萄酒的重要香氣成分,絕大多數的酯類能產生令人愉悅的香氣,大部分酯類物質感官特性為水果香味[24]。由此推測,MLF試樣中,C5酒樣水果香較其他酒樣好。這可能是由于C5乳酸菌是篩自泡菜的植物乳桿菌,其酯酶活性較其他篩自酸奶的乳酸菌菌株高,促進了酯類物質的形成。

表1 葡萄酒樣的揮發性化合物組成

續表

注:
注:表中“-”表示未檢出;“—”表示感官特性未見報道。

圖7 不同乳酸菌株MLF后與對照酒樣酯類比較Fig.7 Comparison of esters indifferent MLF wine samples with control

2.4 酸類成分比較

由圖8可知,對照試樣檢測出6種揮發酸,相對含量占4.00%;C5酒樣酸類物質種類及相對含量最少,占1.23%,僅為對照的31%;N9酒樣4種酸,占2.91%;N8和N13酒樣酸種類都為5種,相對含量分別為4.21%、3.46%。5種試樣中共有酸類2種,分別是乙酸和辛酸。和對照試樣相比,經過乳酸發酵的試樣中乙酸含量都有所增加,C5酒樣增加最少,占0.75%。其他MLF試樣乙酸相對含量都較高,N8酒樣最高,達1.59%,其次是N13、N9,乙酸分別占1.4%和1.44%。辛酸在對照試樣中最高,達1.91%,4種MLF試樣均下降到0.6%以下。揮發酸具有不愉快的氣味,較高的揮發酸能掩蓋葡萄酒的香氣,對葡萄酒的感官品質造成負面影響[25],所以認為C5酒樣較其他酒樣香型更好。

圖8 不同乳酸菌株MLF后與對照酒樣酸類變化比較Fig.8 Comparison of acids indifferent MLF wine samples with control

2.5 主要揮發性組分的分析比較

5種試樣中相對含量較高的共有揮發性成分比較(圖9)顯示,對照試樣中的苯乙醇相對含量低于4種MLF試樣,N8酒樣相對含量最高,是對照的2.5倍,說明N8菌蘋乳發酵可顯著增加葡萄酒愉快的花香感;對照酒樣的辛酸乙酯相對含量最高,為其他試樣的2倍以上,可見MLF處理可降低辛酸乙酯的相對含量。N9和N13酒樣辛酸乙酯下降幅度最大,約為對照的16%。C5降低較少,約為對照43%;具有青草或香蕉香感的戊醇,在C5酒樣和N8酒樣的相對含量較低與對照無明顯差異,在N9酒樣和N13酒樣相對含量較高,為對照的2倍;C5酒樣中具有果香、酯香正己酸乙酯較高,其它三種酒樣的含量相差不大,對照酒樣中不含己酸乙酯,說明它是MLF生成的;具有香蕉、果香感的乙酸異戊酯在C5酒樣中含量最高,是對照的1.5倍,其他三種酒樣相差不大,僅為對照的一半。C5酒樣中各主要香氣物質相對含量較均一,酒樣酒香、果香、花香、脂肪和醛香較為協調;N8酒樣中具有花香、玫瑰香的苯乙醇占23.84%,花香突出;N9、N13酒樣中1-戊醇相對含量均最高,分別為29.96%、31.39%,青草香、香蕉香突出;對照酒樣中辛酸乙酯達到31.22%,花果香、醛香突出。

圖9 幾種酒樣主要揮發性成分比較Fig.9 Comparison of major volatile components from samples

3 結論

3.1 MLF試樣中共初步分離定性出70種揮發性成分,其中C5酒樣中檢出42種,N8酒樣檢出46種,N9酒樣檢出46種,N13酒樣檢出48種,對照酒樣檢出35種。MLF試樣中揮發性化合物種類均多于對照,釋放量較對照大。說明MLF過程樣品中有新的揮發性組分形成,同時促進揮發性物質的釋放。

3.2 5種試樣共有揮發性組分18種,MLF試樣共有組分25種,MLF新產生7種揮發性物質,分別是葉醇、芳樟醇、苯甲醇、正己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、大馬士酮。這些物質主要增加了產品的青香、花香、果香、奶油香等香氣,對葡萄酒香氣品質有修飾作用。

3.3 乳酸菌來源不同,MLF試樣香氣表現不同。C5酒樣,酯類相對含量最高,酸類相對含量最低,樣品酒香、果香、花果、脂肪和醛香相協調;N8酒樣,醇類相對含量最高,花香突出;N9和N13酒樣中青草香、香蕉香突出;對照酒樣花果和醛香突出。相比于其他菌株C5乳酸菌MLF酒樣果香型較好且不良風味物質少。

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Impact of several strains of lactic acid bacteria on the volatile components of dry red wine

ZHOU An-ling,MI Lan,LI Ji-xin,JIANG Yu-mei*

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The dry red wine completed the alcohol fermentation was used as raw material. 4 of lactic acid bacteria were screened to conduct malic acid-lactic acid fermentation(MLF),malolactic un-fermentation as control sample. The volatile components of samples were detected by head space solid-phase micro-extraction with gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME/GC-MS). The results showed that,70 volatile components were detected from 4 MLF samples,42,46,46 and 48 kinds of volatile compounds were separately determined from C5,N8,N9 and N13 sample. 35 kinds of volatile compounds were come from control sample. The quantity of volatile components from MLF samples were more than control sample,indicating some new volatile components were produced during MLF,at the same time,the quality of the wine aroma had a modification. The esters of C5 sample was higher than other 3 samples,the relative content of 56.48%,the volatile acids was minimum of 1.23%,the volatile quality was better than other test samples. C5 lactobacillus was filtrated from pickled vegetable.

lactobacillus;volatile compound;malolactic fermentation;headspace solid phase micro extraction(HS-SPME);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2014-09-22

周安玲(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mail：1042501372@qq.com。

*通訊作者:蔣玉梅(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：果蔬加工、葡萄酒、食品風味物質分析的研究，E-mail：jym316@126.com。

“隴原青年創新人才扶持計劃”項目；財政廳甘肅省高等學校基本科研業務費項目(2010-1-235)；省科技廳科技支撐計劃(1011NKCA059)；盛彤笙科技創新基金(GSAU-STS-1335)。

TS262.6

A

1002-0306(2015)15-0136-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.021