溫度及乳酸鏈球菌素對單增李斯特菌的抑制作用

姜愛麗,胡文忠，*,崔曉亭,陳 晨,薩仁高娃,李佳慧

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

溫度及乳酸鏈球菌素對單增李斯特菌的抑制作用

姜愛麗1,胡文忠1，*,崔曉亭1,陳 晨1,薩仁高娃2,李佳慧1

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

通過Matlab軟件擬合Gompertz生長模型,研究了溫度對單增李斯特菌(Listeria.monocytogenes,LM)的影響;同時,研究了不同濃度(5、10、50、100、150 μg/mL)、pH(1、3、5、7、9)、溫度(45、75、95、115、121℃)條件下的乳酸鏈球菌素對LM殺菌活性的影響,旨在為LM的監控技術發展提供理論依據。結果表明:低溫的抑制效果明顯,最大細胞密度減少了4.3455 lg cfu/mL;乳酸鏈球菌素濃度低于5 μg/mL時能促進LM的生長,高于10 μg/mL時,對LM有一定的殺菌作用,高于150 μg/mL時,48 h之內幾乎可以殺死營養肉湯中的所有LM;乳酸鏈球菌素對酸性有協同效應;并有較好的熱穩定性。

單增李斯特菌,生長模型,乳酸鏈球菌素,溫度,pH

李斯特菌是一類革蘭氏陽性菌,共有七個種。其中單增李斯特菌(Listeria.Monocytogenes,LM)是唯一能引起人類致病的病原菌,也是一類人畜共患病的病原菌[1]。乳酸鏈球菌素又稱乳球菌肽或乳鏈菌肽,英文名為Nisin,是N型血清的某些乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的具有很強殺菌作用的小肽。盡管很多學者進行了大量的研究,但目前對乳酸鏈球菌素的抑菌機理尚未定論。近年來,部分學者又提出“孔道理論”,認為乳酸鏈球菌素是一個疏水的帶正電荷的陽離子分子,在一定膜電位存在下,可吸附于敏感菌的細胞膜上,通過C末端作用侵入細胞內形成通透性孔道,細胞膜失去極化,細胞內小分子流失,細胞外水分子的流入,造成細胞膜內外能差消失,導致細胞自溶而死亡,總體上可以認為,乳酸鏈球菌素對芽孢的作用是在萌發前期及膨脹期破壞其膜,抑制其發芽過程[2]。目前,針對單增李斯特菌的乳酸鏈球菌素控制技術國內外研究很廣泛[3-5],但還沒有研究不同濃度乳酸鏈球菌素在不同pH和不同溫度下對LM的抑制作用方面的研究。本文研究了不同溫度下LM的生長情況及不同條件下乳酸鏈球菌素抑制LM的效果,旨在為LM監控技術的發展提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:LM標準菌株購自北京北納創聯生物技術研究院(編號:GIM1.229);含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE) 青島海博生物技術有限公司;含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE) 青島海博生物技術有限公司;乳酸鏈球菌素:食品級 浙江銀像食品有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、酒精 均為分析純。

HYC-326A醫用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司;MLS-3020 全自動高壓蒸汽滅菌器 日本SANYO公司;DNP-9052電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;YLE-1000電熱恒溫水浴鍋 北京東方精瑞科技發展有限公司;AB135-S分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;Acol-super全自動菌落計數儀 英國synbiosis公司;1300系列A2型二級生物安全柜 美國Thermo Fisher Scientific公司;HR40-IIA2二級生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LM原菌落懸浮液的制備 在無菌室的生物安全柜里以無菌操作取TSA-YE斜面上的標準菌株,在TSA-YE平板上進行劃線,36 ℃培養24 h后活化,接種單增李斯特菌單菌落于含150 mL TSB-YE中,充分混勻,將三角瓶放入36 ℃培養箱,培養5～12 h至初始菌落數大致為104～105cfu/mL,即原菌液,于4 ℃保存備用。

1.2.2 TSB-YE中LM計數 將制得的原菌落懸浮液置于36℃培養箱培養,每隔4h取樣,采用涂布平板培養法[6]計活菌數,計數平板為TSA-YE 。按下列公式計算每毫升樣品中的含菌量:每毫升樣品中的菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復的平均菌落數×稀釋倍數×10。

用相同的方法,將原菌液分別置于4、25、30 ℃的培養箱中培養,每隔一定時間取樣計數。初級模型利用Matlab軟件建立Gompertz模型。

Gompertz模型:

Nt=A+C·exp(-exp(-B(t-M)))

式(1)

U=BC/e

式(2)

LPD=M-1/B

式(3)

MPD=A+C

式(4)

式中:t表示時間(h),Nt表示t時的菌數,A表示初始菌數N0(lg cfu/mL),C表示最大菌數Nmax與初始菌數N0的差值(lg cfu/mL),B為在時間點M時的相對最大生長速率(h-1),M表示達到最大生長速率所需的時間(h),U表示微生物生長的最大比生長速率(lg cfu/mL·h),LPD表示微生物生長的延滯期(h),MPD表示微生物生長的最大細胞密度(lg cfu/mL),e=2.7182[7]。

1.2.3 不同濃度乳酸鏈球菌素溶液的配制 用0.02 mol/L HCl配制濃度為5、10、50、100、150 μg/mL的乳酸鏈球菌溶液(pH1.7)[5]。將原菌落懸浮液與上述制得的不同濃度的乳酸鏈球菌素溶液以體積比1∶10進行混合。充分振蕩3 min。然后用無菌生理鹽水對上述混合液進行梯度稀釋。取100 μL稀釋液涂布于TSA-YE平板上,在36 ℃培養恒溫培養箱中培養48 h后計錄活菌數。

1.2.4 不同pH乳酸鏈球菌素溶液的配制 配制不同濃度下的乳酸鏈球菌素溶液,采用濾膜過濾以達到消毒的效果,用濃度為1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節乳酸鏈球菌素溶液的pH,最終調制成不同的pH(1.0,3.0,5.0,7.0,9.0),進行抑菌效果實驗。同樣將原菌落懸浮液和不同pH下的一定濃度的乳酸鏈球菌素溶液以體積比1∶10進行混合,充分震蕩3 min,并將上述混合液進行梯度稀釋。然后將上述稀釋液用移液槍取100 μL涂布在TSA-YE平板上,放置于36 ℃恒溫培養箱中培養48 h后計數。

1.2.5 不同溫度對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 用濃度為0.02 mol/mL 的稀鹽酸溶液配制濃度為10 mg/mL的乳酸鏈球菌素(pH1.7),濾膜過濾消毒,分別將其在不同的溫度(45、75、95、115、121 ℃)下加熱20 min,以36 ℃條件下的乳酸鏈球菌素原液作為實驗的對照,進行抑菌實驗。

1.2.6 統計分析 采用 SPSS17.0軟件進行方差分析,用Microsoft Office Excel作圖。

2 結果與討論

2.1 不同溫度下的LM在TSB-YE中的生長曲線及模型參數

由Matlab軟件擬合LM在TSB-YE中的Gompertz生長模型,見圖1。R2及得到相應的生長參數:最大比生長速率U,生長延滯期LPD和最大細胞密度MPD,結果見表1。可以看出,由Gompertz模型擬合的生長曲線都很好,R2均在0.9937以上。不同溫度下LM的最大比生長速率U的排列順序如下所示,4 ℃<25 ℃<30 ℃<36 ℃。隨著溫度的升高,LM在不同溫度下生長延滯期的順序為4 ℃>25 ℃>30 ℃>36 ℃。隨著溫度的升高,最大細胞密度MPD增加,LM在不同溫度下生長最大細胞密度的順序為4 ℃<25 ℃<30℃<36 ℃,4 ℃時MPD較36 ℃時減少4.3455 lg cfu/mL。綜上所述,隨著溫度的升高,U增大,LPD減小,MPD增加。36 ℃時最適宜LM生長,4 ℃時LM的生長緩慢。該結果顯示的趨勢與其他研究者的相同[7],溫度越低,微生物中各種酶的活性受到抑制,導致生長速度逐漸變慢。

圖1 不同溫度下用Gompertz模型擬合出的LM在TSB-YE中的生長曲線Fig.1 The growth curve of LM in TSB-YE fit withGompertz model under different temperatures

2.2 乳酸鏈球菌素濃度對其抑菌性的影響

由表2可知,當乳酸鏈球菌素濃度低于5 μg/mL時,對單增李斯特菌的生長沒有起到抑制的作用,反而起了促進其生長的作用。當乳酸鏈球菌素的濃度高于10 μg/mL時,對LM發揮殺菌的作用。當乳酸鏈球菌素濃度高達150 μg/mL時,在48 h內幾乎可以將培養基中的所有LM殺死(p<0.05)。

2.3 不同pH對乳酸鏈球菌素抑制單增李斯特菌的影響

由圖2可以看出,隨著pH的變化,乳酸鏈球菌素的抑菌及殺菌效果也隨之發生了改變。乳酸鏈球菌素的濃度越高,pH越低,則抑菌或殺菌效果越強。當pH為1時,乳酸鏈球菌素的濃度為100 μg/mL時,48 h內可以使LM的活菌數低于檢測限。當pH>7時,乳酸鏈球菌素濃度低于10 μg/mL時,沒有殺菌的作用。當pH<5時,乳酸鏈球菌素濃度高于10 μg/mL時,對LM起到了殺菌的功效。結果表明,乳酸鏈球菌素在偏酸性條件下殺菌活性比較強,偏中性及堿性則殺菌效果不明顯(p<0.05)。

圖2 不同pH對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on activity ofanti-bacteria with Nisin

2.4 不同熱處理溫度對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

由圖3可以看出,將乳酸鏈球菌素加熱到45 ℃后其所表現出的抑菌活性最高,而加熱到121 ℃時乳酸鏈球菌素所表現出的抑菌及殺菌活性最差,不過其抑菌活性仍然高于未經熱處理時的乳酸鏈球菌素的抑菌活性。結果表明,將乳酸鏈球菌素經過加熱處理后,它的抑菌活性雖然有略微的提高,不過提高的程度很小,與對照(36 ℃)相比差異不顯著(p>0.05)。說明乳酸鏈球菌素對熱有較好的穩定性。

圖3 加熱處理對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pre-heating on activityof anti-bacteria with Nisin

3 結論

微生物生長的初級模型一般是由S形生長曲線描述[8-10],雖然有多種模型能夠擬合微生物的生長曲線,但Gompertz模型能更好地描述微生物的生長及變化[11]。從不同的溫度下LM生長的最大比生長速率可以看出,36 ℃時生長延滯期最短為1.7054,是這4個溫度中最適宜LM生長繁殖的溫度。4 ℃時LM生長極其緩慢,延滯期長達約32 h,最大細胞密度為4.0517,雖然生長極其緩慢,但在此溫度下仍具有一定的生長量。

表1 在不同溫度下Gompertz模型擬合的LM在TSB-YE中的生長曲線的R2和生長參數

表2 不同濃度的乳酸鏈球菌素條件下的LM在營養肉湯中的的活菌數量(lg cfu/mL)

乳酸鏈球菌素的初始濃度對其抑菌性活性有顯著影響,當其濃度低于5 μg/mL時,乳酸練球菌素不但沒有抑制LM的生長,反而促進了LM的生長。當乳酸鏈球菌素的濃度高于10 μg/mL時,具有一定的抑菌及殺菌作用。當濃度高達150 μg/mL時,可以在48 h之內將培養基中的LM全部殺死。正如文獻[12]報道,因為較高濃度的乳酸鏈球菌素吸附在細胞膜上,進而使得LM的細胞壁中的肽聚糖的形成受到了影響,使得細胞膜和磷脂類物質的代謝合成受阻,最終結果導致LM細胞內的物質向外滲漏,LM細胞由于裂解而死亡。以此達到抑菌或殺菌的效果。

隨著pH的不斷升高,乳酸鏈球菌素的抑菌及殺菌活性表現出下降的趨勢。當pH為1時,乳酸鏈球菌素的濃度為100 μg/mL時,在48 h之內能使LM活菌數量降低到規定的檢測限之下[13-14]。結果表明乳酸鏈球菌素在酸性條件下表現出更為穩定的抑菌效應。

乳酸鏈球菌素經過加熱處理后,其抑菌活性雖然有所提高,但整體所表現出的變化幅度很小,說明乳酸鏈球菌素在較高的溫度下有很好的熱穩定性。

[1]葛素君,許際華,馮濟富,等. 運用“染片指引法”對產單核李斯特菌暴發食物中毒的診斷及其意義[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(1):94-95.

[2]黃群,麻成金,歐陽玉祝,等. 傳統湘西熟肉發酵動態與Nisin保鮮實驗[J]. 食品與發酵工業,2008,34(4):167-170.

[3]陳晨,胡文忠,何煜波,等. Nisin和檸檬酸對純培養及鮮切黃瓜中單增李斯特菌的殺菌效果[J]. 食品工業科技,2014,35(5):273-276.

[4]潘利華,劉竹青,于薈,等. 單核細胞增生李斯特菌復合抑菌及的研究[J]. 食品工業科技,2012,33(8):344-362.

[5]Esmail Abdollahzadeh,Masoud Rezaei,hedayathosseini. Antibacterial activity of plant essential oils and extracts:The role of thyme essential oil,nisin,and their combination to controlListeriamonocytogenesinoculated in minced fish meat[J]. Food Control,2014,35(1):177-183.

[6]李平蘭,賀稚非. 食品微生物學實驗原理與技術[M].北京:中國農業出版社,2005:42-44.

[7]薩仁高娃,胡文忠,高春紅,等. 不同初始濃度的單增李斯特菌在營養肉湯中生長預測模型的建立[J].食品工業科技,2013,34(17):173-176.

[8]邵俊花,葛長榮. 單核細胞增生性李斯特菌污染及檢測方法進展[J].食品科技,2007,12(1):11-14.

[9]Jacxsens L,Luning P A,van der Vorst J G A J,et al. Simulation modelling and risk assessment as tools to identify the impact of climate change on microbiological food safety-The case study of fresh produce supply chain[J]. Food Research International,2010,43:1925-1935.

[10]Saucedo-Reyes D,Marco-Celdrán A,Pina-Pérez M C,et al. Modeling survival ofhighhydrostatic pressure treated stationary- and exponential-phase Listeria innocua cells[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies,2009,10:135-141.

[11]李東,孫健,彭沈軍. 天然食品防腐劑乳酸鏈球菌素的研究進展[J]. 食品發酵工業,1995,(4):58-61.

[12]湯鳳霞,蔡慧農. 微生物防腐劑Nisin的應用[J]. 食品科技,2002(11):46-48.

[13]Sun-Kyungheo,Hee-Seok Lee,Sang-Doha. A predictive model for the growth rate of Bacillus cereus in broth by response surface methodology[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2009,14(2):202-206.

[14]鄭利敏,董慶利,丁天,等. 即食涼拌菜中單增李斯特菌生長模型的建立[J]. 食品科學,2013,34(15):22-26.

Inhibition of temperature and Nisin onListeriamonocytogenes

JIANG Ai-li1,HU Wen-zhong1,*,CUI Xiao-ting1,CHEN Chen1,Sa-ren-gao-wa2,LI Jia-hui1

(1.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The effect of different temperatures on growth ofListeriamonocytogenes(LM)was studied,and Gompertz model was fit using Matlab software. In order to provide theory foundation for the development of supervisory technique,the antibacterial activity of Nisin under the different concentrations(5,10,50,100,150 μg/mL),pH(1,3,5,7,9)and temperatures(45,75,95,115,121 ℃)were studied simultaneously. The results demonstrated that low temperature appeared significantly inhibiting effect,the maximum cell density was reduced by 4.3455 lg cfu/mL. The growth of LM was promoted when the concentration of Nisin was<5 μg/mL. The bactericidal effects was the concentration of Nisin>10 μg/mL. When the concentration of Nisin was>150 μg/mL,it was able to kill almost allL.monocytogenesin nutritional broth during the period of 48 h cultivation. Nisin has a synergistic effect under acidic environment and a good thermal stability.

Listeriamonocytogenes;growth model;Nisin;temperature;pH

2014-10-21

姜愛麗(1971-),女,博士,副教授,研究方向:采后生物學與技術,E-mail:jal@dlnu.edu.cn。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士,教授,研究方向:食品科學與工程,E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05);國家自然科學基金資助項目(31172009);中央高校基本科研業務費項目(DC2013010107);遼寧省科技廳基金。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0157-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.025