中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白制備抗氧化肽的研究

高丹丹,蘭家國(guó),趙佩佩,曹 竑

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白制備抗氧化肽的研究

高丹丹,蘭家國(guó),趙佩佩,曹 竑

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

藏羊血清蛋白,中性蛋白酶,水解,響應(yīng)面,抗氧化活性

羊血即牛科動(dòng)物山羊或綿羊的血,主要成分為多種蛋白質(zhì)，含少量脂類、葡萄糖及無機(jī)鹽等。蛋白質(zhì)主要是血紅蛋白,其次是血清白蛋白、血清球蛋白和少量纖維蛋白。羊血性平、味咸,入脾經(jīng);主要用于各種內(nèi)出血、外傷出血的食療[1]。近幾年來采用動(dòng)物血液蛋白源制備生物肽的研究較為活躍,Brant[2]報(bào)道從牛血血紅蛋白中分離得到兩種嗎啡肽。任建東等[3]曾報(bào)道過在鹿茸血的Alcalase水解物有抗氧化活性和ACE抑制活性;劉騫[4]等人研究了酶水解豬血漿蛋白的工藝條件,獲得具有抗氧化活性的豬血漿蛋白肽。2011年,Adje[5]等采用胃蛋白酶水解牛血紅蛋白得到26段血紅蛋白源抗菌片段,其中13段是新發(fā)現(xiàn)的抑菌肽。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)藏羊血清水解肽的研究較少。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上采用中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology,RSM)對(duì)水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)水解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行分析,為藏羊血清蛋白抗氧化活性肽的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏羊血清蛋白(藏系綿羊血清采取于青海省海西州天峻縣,經(jīng)真空冷凍干燥,-20 ℃保存待用)。

中性蛋白酶(90000 U/g,中生瑞泰);DPPH、BHT 美國(guó)sigma公司;鄰二氮菲、鄰苯三酚(沒食子酚)、菲咯嗪、Tris等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003N電子天平 上海天平儀器廠;PB-10型精密pH計(jì) Sartorius公司;HWS28型電熱恒溫水浴鍋 西安禾普生物科技有限公司;GL-3250B控溫磁力攪拌器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司;TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Labconco Freezoneil臺(tái)式凍干系統(tǒng) 上海比朗儀器有限公司;6010型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)惠普有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藏羊血清蛋白酶液的制備 準(zhǔn)確稱取5 g藏羊血清蛋白,加入100 mL的超純水溶解,調(diào)節(jié)其至一定pH,加入一定量的酶,在特定的溫度下進(jìn)行水解,95 ℃滅酶15 min,加入一定量10% TCA后,8000 r/min離心15 min,取上清液待分析用。

1.3.2 水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定方法采用茚三酮比色法[6],計(jì)算公式如下:

式中:As為酶解液中的總游離氨基數(shù),mmol;A1為原料蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離氨基數(shù),mmol;A0為原料蛋白中固有的游離氨基數(shù),mmol。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以藏羊血清蛋白水解度(DH)為評(píng)價(jià)指標(biāo),pH為7,反應(yīng)時(shí)間為4 h,溫度為50 ℃的條件下,研究不同[E]/[S](800、1600、2400、3200、4000 U/g)對(duì)水解度的影響;在pH為7,反應(yīng)時(shí)間為4 h,[E]/[S]為2400 U/g的條件下,研究不同溫度(分別為30、40、50、60、70 ℃)對(duì)水解度的影響。在溫度為50 ℃,反應(yīng)時(shí)間為4 h,[E]/[S]為2400 U/g的條件下,研究不同pH(分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)對(duì)水解度的影響;在溫度為50 ℃,pH為7.0,[E]/[S]為2400 U/g的條件下,研究不同反應(yīng)時(shí)間(分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h)對(duì)水解效果的影響,確定各因素的最佳水平。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,選取溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)顯著的因素為自變量(分別以A、B、C表示),以水解度為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),因素水平如表1所示,處理數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0完成。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5 藏羊血清多肽抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 將凍干的多肽粉末配制成1、2、4、6、8 mg/mL的多肽溶液,分別吸取各濃度的多肽液和1%的BHT溶液1 mL于試管中,加入0.4 mmol/L的DPPH自由基溶液(用無水乙醇配制)0.2 mL和2.0 mL的蒸餾水,混勻反應(yīng)體系,室溫下置于黑暗中反應(yīng)30 min,517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1。以等體積的無水乙醇代替DPPH溶液為空白組,記為A2;以同體積的蒸餾水代替樣品溶液為對(duì)照組,記為A0。所有測(cè)定值均為三次結(jié)果的平均值,根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率[7]。

式中:A0為對(duì)照實(shí)驗(yàn)(水代樣品溶液)的吸光度;A1為樣品實(shí)驗(yàn)吸光度;A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)(無水乙醇代DPPH溶液)的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基(·OH)清除能力測(cè)定 采用鄰二氮菲法。參考吳淳濤[8]等人的方法并稍加改進(jìn)。準(zhǔn)確量取0.75mmol/L的鄰二氮菲溶液1.0mL于試管中,再依次加入pH為7.4的PBS緩沖液2.0mL以及蒸餾水1.0mL,混勻反應(yīng)體系,加入1.0mL的0.75mmol/LFeSO4溶液,然后用0.12%的雙氧水(現(xiàn)配現(xiàn)用)1.0mL啟動(dòng)反應(yīng),立即震蕩混勻,記為AP;用同體積的蒸餾水代替0.12%的雙氧水,其余的條件均同AP處理方法,記為Ab;用同體積的多肽液代替1.0mL的蒸餾水,其余條件均同AP處理方法,記為As。三個(gè)管AP、Ab、As置于37 ℃水浴鍋中保溫1h,反應(yīng)結(jié)束后,以蒸餾水調(diào)零,在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度,并計(jì)算羥自由基的清除率。

式中:Ap為1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+1mLH2O2+1mLH2O的吸光值;Ab為1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+2mLH2O的吸光值;As為1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+1mLH2O2+1mL樣品溶液的吸光值。

式中:A空為空白對(duì)照液的吸光值;A樣為樣品溶液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用F檢驗(yàn)對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義,數(shù)據(jù)分析軟件采用DesignExpert8.0和SPSS19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶與底物濃度比([E]/[S])對(duì)水解效果的影響 不同[E]/[S]對(duì)藏羊血清蛋白水解度的影響如圖1所示,水解度隨著加酶量的增加而增加,加酶量800U/g到2400U/g變化的幅度較大。此后,隨著加酶量的增加其曲線上升的趨勢(shì)幅度變小。這是因?yàn)榧用噶吭谝欢ǚ秶鷥?nèi),隨著加酶量的提高,反應(yīng)體系水解度逐漸上升,當(dāng)加酶量超出一定范圍后,由于酶濃度逐漸飽和,使酶解速度的增加趨于飽和[10],此時(shí)繼續(xù)增大加酶量對(duì)反應(yīng)速率無大的影響,且過分的酶解還會(huì)產(chǎn)生苦味物質(zhì)。因此,確定其最適合的加酶量為2400U/g。

圖1 [E]/[S]對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of [E]/[S]on the degree of hydrolysis

2.1.2 溫度對(duì)水解度的影響 溫度對(duì)藏羊血清蛋白水解度的影響如圖2所示,水解度在溫度30～50 ℃隨著溫度的升高而增加,隨著溫度的繼續(xù)上升其水解度呈下降的趨勢(shì)。此后,隨著溫度的增加其曲線上升的趨勢(shì)幅度變小。這是因?yàn)闇囟葘?duì)酶促反應(yīng)的影響一般有兩個(gè)方面:一方面是當(dāng)溫度升高時(shí),反應(yīng)速度加快;另一方面,隨著溫度的升高,酶逐漸發(fā)生了變性,因而反應(yīng)速度降低,酶促反應(yīng)的最適溫度就是這兩種過程平衡的結(jié)果。在低于最適溫度時(shí),以前一種效應(yīng)為主;而在高于最適溫度時(shí),以后一種效應(yīng)為主[11]。在酶解的最初階段,酶變性尚未表現(xiàn)出來,前一種效應(yīng)占主導(dǎo)地位,所以當(dāng)溫度低于50 ℃時(shí),水解度隨溫度升高而增加;但當(dāng)溫度高過最適宜溫度時(shí),酶蛋白變性逐漸突出,后一種效應(yīng)占主導(dǎo)地位,所以當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí),水解度隨溫度升高反而降低;當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí),水解度最大。因此,確定其最適合的溫度是50 ℃。

2.1.3 pH對(duì)水解度的影響 pH對(duì)藏羊血清蛋白水解度的影響如圖3所示,可知水解度在pH從5.0～7.0隨著pH的升高而增加,之后隨著pH繼續(xù)增大其水解度呈下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)槊恳环N酶都有其適合的pH作用范圍,在這個(gè)作用范圍內(nèi)酶的催化活性部位含有的可解離的基團(tuán)得到了最充分的解離,使酶的活性中心與蛋白質(zhì)底物充分結(jié)合,從而將底物最大程度地轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物,使水解度達(dá)到最大值,pH偏高偏低都會(huì)導(dǎo)致水解度的下降。因此,本研究確定其最適合的pH是7.0。

圖2 溫度對(duì)水解度的影響 Fig.2 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

圖3 pH對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of pH value on the degree of hydrolysis

2.1.4 時(shí)間對(duì)水解度的影響 水解時(shí)間對(duì)藏羊血清蛋白水解度的影響如圖4,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),水解度逐漸升高。但當(dāng)水解到5 h后,水解度變化趨于平緩。究其原因,隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行:底物濃度減小,反應(yīng)位點(diǎn)逐漸被酶分子飽和;產(chǎn)物濃度增加,其競(jìng)爭(zhēng)性抑制變強(qiáng);酶活性隨反應(yīng)時(shí)間增加會(huì)降低;中間復(fù)合物[ES]在經(jīng)歷了初始階段的積累后達(dá)到穩(wěn)態(tài),趨于恒定[12]。從節(jié)約時(shí)間和能源的角度考慮,確定其最適合的水解時(shí)間是5 h。

圖4 時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn) 從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,水解度隨著酶添加量的增加而增加,在實(shí)際生產(chǎn)過程中酶添加量越多,勢(shì)必會(huì)增加生產(chǎn)成本,所以在響應(yīng)面中不考慮酶加量因素,而直接取最適宜的酶加量2400 U/g。選擇對(duì)水解度影響最為顯著的三個(gè)因素:溫度(A)、pH(B)和時(shí)間(C)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了17 組實(shí)驗(yàn),其中5 組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0采用中心組合實(shí)驗(yàn) Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,對(duì) pH、溫度、酶解時(shí)間三個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,獲得二次回歸方程如下:DH=15.42+0.78A+0.050B+1.38C-2.31A2-1.26B2-0.66C2-0.15AB-1.35AC-0.10BC運(yùn)用響應(yīng)面回歸程序(Response Surface Regression,RSR)對(duì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,得到回歸模型的方差分析表3。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表

在回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表4顯示:A、C、A2、B2和AC這幾個(gè)因素對(duì)水解度的影響顯著,其中溫度、時(shí)間對(duì)水解度的影響顯著并且溫度和時(shí)間的交互作用也對(duì)水解度的影響顯著。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

注:
注:*表示在5%的水平內(nèi)顯著(0.01

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 RSM的分析圖是特定的響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)于因素A、B、C(A為反應(yīng)溫度;B為反應(yīng)pH;C為反應(yīng)時(shí)間)構(gòu)成的一個(gè)三維空間的響應(yīng)面圖在二維平面上的等高線圖,可以直觀地反映出因素對(duì)響應(yīng)值的影響,以及因素之間的相互作用,并且可以看出存在的極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表示兩因素交互作用不顯著[13]。通過上述二次多項(xiàng)回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖5。通過該組動(dòng)態(tài)圖即可對(duì)任何兩因素交互影響水解度效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià),并從中確定最佳因素水平范圍。

圖5 兩因素交互作用對(duì)水解度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for theeffect of operating parameters on the degree of hydrolysis

圖5(a)為固定時(shí)間為5h,溫度和pH對(duì)水解度的三維響應(yīng)面和二維等值曲線圖,由圖可知溫度和pH的交互作用不明顯。圖5(b)為固定pH7、溫度與時(shí)間對(duì)水解度影響的三維響應(yīng)曲面和二維等值線圖。從圖中可見,溫度和時(shí)間的交互作用較為顯著,溫度在40～48 ℃,反應(yīng)時(shí)間在4～5.2 h范圍內(nèi),與水解度呈正相關(guān)關(guān)系,水解度從8.5%上升至15.83%。此后水解度曲線趨于平緩,等值線的間距變寬,繼續(xù)增加溫度或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響不大。圖5(c)中為溫度為50 ℃、時(shí)間與pH對(duì)水解度影響的三維響應(yīng)曲面和二維等值線圖,圖中顯示時(shí)間與pH的交互作用不顯著。

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程,利用Design Expert 8.0軟件獲得了水解度最高時(shí)的各個(gè)因素的最佳水解條件為最優(yōu)水解條件為溫度50.27 ℃,水解時(shí)間為5.55 h,水解pH為6.78,在此水解條件下,水解度可達(dá)到15.91%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,在溫度50 ℃,水解時(shí)間為5.5 h,水解pH為6.8下進(jìn)行水解做了3平行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果分別為15.05%、15.44%和15.84%,平均值為15.44%,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)=0.395%,可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際水解情況。

2.3 藏羊血清蛋白肽的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖6可知,藏羊血清蛋白的中性蛋白酶水解物對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用,并且隨著多肽溶液濃度的增大而增大,這說明藏羊血清蛋白多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力在一定的濃度范圍內(nèi)有良好的量效關(guān)系。當(dāng)多肽的濃度為8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到最大(76.06±0.74)%,而在相同的系統(tǒng)中1%的BHT的DPPH自由基清除率(98.40±0.43)%。多肽對(duì)DPPH自由基的IC50值為6.035 mg/mL。

圖6 DPPH清除能力Fig.6 The scavenging ability of DPPH

2.3.2 羥自由基(·OH)清除能力 由圖7可知,1%的BHT對(duì)所建體系的·OH清除率為(90.07±0.66)%,藏羊血清蛋白多肽濃度增大時(shí),對(duì)·OH的清除作用明顯增大。當(dāng)多肽濃度為1 mg/mL時(shí)清除率為(24.51±1.37)%,2 mg/mL時(shí)清除率為(31.91±1.95)%,4 mg/mL時(shí)清除率為(46.70±1.85)%,6 mg/mL時(shí)清除率為(59.85±1.42)%,當(dāng)多肽濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí)清除率為(79.76±0.79)%,多肽對(duì)羥自由基的IC50值為3.555 mg/mL。

圖7 羥自由基清除能力Fig.7 The scavenging ability of hydroxyl radical

圖8 超氧陰離子清除能力Fig.8 The scavenging ability of superoxide radical

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn),確定了最適加酶量為2400 U/g,最適溫度為50 ℃,最適pH為7,最適水解反應(yīng)時(shí)間為5 h。以此為基礎(chǔ),并且以水解度為最終評(píng)價(jià)指標(biāo),通過三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)蛋白酶水解蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳的水解條件為:溫度50.27 ℃,水解時(shí)間為5.55 h,水解pH為6.78,在此條件下水解度可達(dá)到15.91%。并對(duì)最佳工藝條件下水解物的抗氧化活性進(jìn)行分析,結(jié)果表明多肽的抗氧化活性和多肽的濃度在一定的濃度范圍內(nèi)有良好的量效關(guān)系,隨著多肽濃度的增大,其抗氧化活性增加,當(dāng)多肽濃度為8 mg/mL時(shí),其DPPH清除率為(76.06±0.74)%,羥自由基清除率為(79.76±0.79)%,超氧陰離子清除率可達(dá)到(77.90±0.67)%。其對(duì)DPPH、羥自由基和超氧陰離子的半抑制濃度(IC50)分別為:6.035、3.555和2.872 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)明確了藏羊血清蛋白肽的體外抗氧化功能,但其與BHT相比抗氧化能力有很大的差距,由于藏羊血清蛋白的中性蛋白酶水解物是一個(gè)復(fù)雜的混合物質(zhì),可能含有高抗氧化活性的成分,也可能含有無活性的或助氧化的成分,需要進(jìn)一步的分離純化。對(duì)于其具體起作用的功效成分和作用機(jī)理,以及相關(guān)功能性食品的研究與開發(fā)還有待于進(jìn)一步研究。

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Preparation of antioxidant peptide by hydrolization of tibitan sheep serum protein by neutral protease

GAO Dan-dan,LAN Jia-guo,ZHAO Pei-pei,CAO Hong

(College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

Tibitan sheep serum protein was hydrolyzed by neutral protease,the influences of the temperature,hydrolysis time,pH value and the substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis of Sheep serum protein were investigated. On the basis of single factor tests and response surface methodology,the optimal working parameters were worked out and tested. The optimum hydrolysis parameters were as follows:when the amount of enzyme was 2400 U/g,hydrolyzing 5.5 hours at temperature 50 ℃ under pH6.8,and the degree of hydrolysis was 15.44±0.395% under the optimum conditions. The antioxidant activities of the hydrolysate was measured by the inhibiting effect on the scavenging ability of 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH),hydroxyl radical and superoxide radical. The antioxidant activities increased with increasing concentrations of test samples. The peptides exhibited high scavenging ability of DPPH,hydroxyl radical and superoxide radical with an IC50value of 6.035,3.555 and 2.872 mg/mL respectively.

tibitan sheep serum protein;neutral protease;hydrolysis;response surface;antioxidant activities

2014-10-11

高丹丹(1983-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:gaodan0322@163.com。

TS254.9

B

1002-0306(2015)15-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.039