酶聯免疫吸附法測定畜禽組織中恩諾沙星的殘留量

楊華生(貴陽市農產品質量安全監督檢驗測試中心，貴州貴陽 550081)

恩諾沙星，又稱乙基環丙沙星、恩氟沙星，相對分子質量為359.4，于1994年投放市場。該藥具有廣譜抗菌效果，對霉菌和革蘭氏陰性菌效力強，具有很強的滲透性，能廣泛分布于組織中，內服及肌肉注射可吸收迅速，30 min后血藥濃度達高峰，血藥濃度高，在體內代謝為同樣具有抗菌活性的環丙沙星，幾乎所有組織的藥物濃度都高于血漿，特別有利于深部組織感染的治療，代謝物生成及消除緩慢。為預防與治療畜禽養殖過程中發生疾病，恩諾沙星被養殖戶廣泛和大量使用，同時也極容易形成此類獸藥及其代謝物在養殖動物產品體內大量殘留并最終被人類食用，從而導致人體內正常菌群產生耐藥性，引發中毒或過敏反應，影響體內核酸的合成。此外，該類藥物還能抑制小兒、孕婦和哺乳期女性軟骨生長，對有藥物過敏史或高敏體質者危害甚大，老年肝腎功能不全患者更易發生藥物蓄積而增加不良反應。恩諾沙星與布洛芬等非甾體類抗炎藥物合用可使神經興奮閾值降低，引起抽搐，增加神經系統毒性等危害［1］，歐盟規定在可食用動物組織中該藥的殘留不能大于30 μg/kg。為此對畜禽組織中恩諾沙星殘留進行測定，并及時規范市場，預防此類藥物對消費者造成傷害，而目前對該藥檢測比較便捷、實用的方法就是使用酶聯免疫吸附法檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備 酶標儀(帶450 nm波長濾光片)、離心機、勻質機、渦旋振蕩器、恒溫培養箱(0～50℃)、冰箱(4～8 ℃)、20～200 μl吸頭及單道可調移液器、20～300 μl多通道可調移液器、V－型槽、感量0.01 g的天平、洗板機、50 ml量筒、500 ml燒杯、酶標板密封膜。

1.2 試劑 甲醇、蒸餾水、可拆式已包被恩諾沙星特異性抗體的聚苯乙烯微孔條(8 行、12 列)、濃度分別為 0、0.5、1.5、4.5、13.5 和40.5 ng/ml恩諾沙星標準品溶液、濃度為 1 000 ng/ml恩諾沙星標準品為質控材料、稀釋/洗滌緩沖液(濃縮)按照一定的比例稀釋后用于酶標板的沖洗、酶標抗原(濃縮)用酶標抗原稀釋液稀釋后使用、單組分底物/發色劑用于酶的催化顯色、反應終止液。除甲醇、蒸餾水、反應終止液外的試劑外在使用前均應儲存于2～8℃的冰箱中。此外，不含恩諾沙星的樣品作為質控QC，用于加標回收，對整個試驗過程進行驗證。

1.3 原理 在酶標板上的微孔中已包被恩諾沙星的特異性抗體，通過加入恩諾沙星標液或組織樣品中的恩諾沙星抗原和辣根過氧化物酶標記的恩諾沙星抗原爭奪酶標板微孔上抗體的結合位點［2］，在室溫孵育條件下發生競爭反應，形成抗體/抗原復合物或抗體/酶標抗原復合物，洗滌酶標板，除去游離的酶標記物，加上單組分底物/發色劑。在一定的溫度范圍內，酶標記抗原上的辣根過氧化物酶催化底物與發色劑發生顯色反應。加入反應終止液后反應停止，同時反應物的顏色由藍色轉為黃色。在酶標儀上450 nm波長處測定相應的吸光度值，吸光度值與恩諾沙星濃度成半對數反比關系。

1.4 試驗方法

1.4.1 組織樣品的制備。稱取1.00 g均質后的組織樣品加入4 ml 70%甲醇溶液并渦旋振蕩1 min，4 000 r/min下離心10 min，移取上清液，用已稀釋的稀釋/洗滌緩沖液按1∶1的比例進行稀釋，稀釋好的樣液用于試驗分析，稀釋倍數為8。只吸取上清液，而不要摻雜固體樣品。

1.4.2 吸光度的測定。待所有試劑的溫度恢復至室溫(20～25℃)后，方可使用。為了降低邊緣效應，建議在反應過程中用酶標板密封膠片將酶標板密封。每個標準、質控或樣品要做2份平行試驗，并做好加樣位置的記錄。酶標板微孔的指定位置如表1所示，每個代號格代表2個孔，平行排列，因此12列則為6列，一般情況下不會排滿。

表1 用于酶標板微孔分析的指定位置

將足夠標準和樣品所用數量的微孔條插入酶標板。用單道移液器吸取標準品或樣品溶液50 μl，分別加入到指定的微孔中，然后用多通道可調移液器吸取75 μl酶標記物加入到每一個微孔中，用酶標板密封膠紙將酶標板蓋住。輕輕拍擊酶標板數秒，室溫(20～25℃)暗處溫育30 min。翻轉酶標板，甩出所有溶液，用已設置好洗版程序的洗板機進行洗板(此清洗程序在沒有條件的情況下進行手工操作)，洗液為已稀釋的稀釋/洗滌緩沖劑，一般清洗由灌注到甩出要重復4～5次。最后1遍沖洗完后，將酶標板在吸水紙上拍干。(將液體甩出后不用翻轉，避免各孔中液體交叉污染［3］，直接扣于吸水紙上拍干即可)，立即移取125 μl底物到酶標板上，然后輕輕拍擊酶標板，在室溫(22～25℃)暗處溫育20 min左右，直至顯色充分，每孔加入100 μl終止液終止反應，顏色會由藍色變為黃色，立即在波長450 nm酶標儀上讀取吸光度。

1.5 結果判定 分別計算標準溶液、質控和樣品的平均吸光值。以吸光度值為縱坐標，以標準濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線可得到質控和樣品的吸光度值。將得到的數值乘以8即為實際結果。結果判定可采用定性及定量2種方法。

1.5.1 定性分析。用樣品的平均吸光度值與標準值進行比較，即得到其濃度范圍。假設樣品T1的吸光度值為1.625，樣品T2的吸光度值為1.269，標準品濃度及相應吸光度值分別為:S1(0 ng/ml)為 2.147，S2(0.5 ng/ml)為 1.850，S3(1.5 ng/ml)為 1.498，S4(4.5 ng/ml)為 1.194，S5(13.5 ng/ml)為0.852，S6(40.5 ng/ml)為 0.490。

1.5.2 定量分析。

1.5.2.1 百分吸光率的計算。按照以下公式計算標準品或樣品的百分吸光率:

式中，B為標準品或樣品溶液的平均吸光度值;B0為0 ng/ml標準溶液的平均吸光度值。

1.5.2.2 標準曲線的繪制。以標準品百分吸光率為縱坐標(Y軸)，以恩諾沙星標準品濃度的對數為橫坐標(X軸)，繪制標準曲線。根據標準曲線得到標液或樣品吸光度值與其濃度的函數關系為:y= －14.276lnx+76.282(R 為0.999 6)。將樣品的百分吸光率代入關系式中，得到樣品所對應的濃度，乘以樣品制備過程中對應的稀釋倍數，即為樣品中恩諾沙星的含量。

2 結果與分析

2.1 定性結果 樣品T1的濃度范圍是0.5～1.5 ng/ml，再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中恩諾沙星殘留的濃度范圍;樣品T2的濃度范圍為1.5～4.5 ng/ml，再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中殘留藥物的含量范圍。

2.2 定量結果 樣品T1、T2含量半定量分別為8.344和26.663 μg/kg。若以大于或等于 30 μg/ml作為陽性判定標準，則T1和T2均為陰性樣品。

2.3 回收率驗證 在質控樣品QC1中加入100 μl濃度為1 000 ng/ml的恩諾沙星標準品作為質控品，理論添加水平為100 μg/kg，其加標樣品參與整個制備過程，實際測試時QC的吸光度為0.881。根據標準曲線得到質控樣品濃度，并乘以稀釋倍數，實測含量為94.583 μg/kg。按照公式回收率R(%)=(加標樣品實際含量/加標樣品理論含量)×100%計算出回收率為94.6%。由此可見，該檢測方法能充分滿足要求。

3 討論

(1)與氣質及液質聯用方法相比，該檢測方法的樣品制備較為簡便、快速，分析技術利用抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合，具有耗時少、靈敏度高，通常從樣品制備到分析測試結果在幾個小時內完成，理論計算含量達到μg/kg級別，但藥品的特異性抗體、包被抗體、催化底物的結合酶等制備要求條件很高，相當專業，成本也十分昂貴，一旦操作分析失誤，會造成較大浪費。因此，整個分析操作過程在環境條件必須達到要求，操作要規范，并嚴格按照操作步驟進行。

(2)由于不同樣品基質的復雜性以及樣品制備過程可能產生某些未知副產物，從而與抗體發生某些非特異性吸附交叉反應，檢測結果允許存在極少數量的假陽性，因而對陽性樣品還要進一步進行定性分析。目前，比較常用的分析方法有液相/串聯質譜(LC-MS-MS)、氣相/串聯質譜GC-MS-MS)。

［1］蔣萍.氟喹諾酮類藥物的不良反應［J］.藥學實踐雜志，1999(2):116－118.

［2］陳佳，李紅梅，徐斐，等.辣根過氧化物酶酶標抗原催化α-萘酚微量熱［J］.食品科學，2009(17):204 －206.

［3］于嘉屏.全自動生化分析儀及其試劑間化學污染對檢測結果的影響［J］.中國檢驗醫學雜志，2007(11):1301－1302.