APP/PS1 小鼠腦內Aβ 水平與認知行為學增齡性變化的研究概述

高堂珂綜述，薛衛國審校

APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠是目前阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)病理學實驗中常用的動物模型，該模型是Jankowsky 實驗室以AD 病理學理論中Aβ 級聯致病假說為基礎［1］，培育出能夠表達人類APP 和PS1 突變基因的轉基因鼠動物模型［2］，該模型可在一定程度上模擬AD 的病理特征和漸進性的病程。近年來，許多使用APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠的實驗中發現，小鼠腦內Aβ 沉積量與其認知功能減退并不成正比，小鼠腦內Aβ 沉積量與其月齡變化關系也沒有較為統一的結論。因此實驗中往往需通過認知行為學數據及Aβ 水平干預措施對進行評價，再進行綜合分析，這樣產生的誤差會影響實驗結果。故本文將結合目前的研究文獻對該雙轉基因鼠表型中的Aβ 病理與行為學是否存在可能的相關性及二者與小鼠月齡的變化關系進行綜述。

1 不同月齡APP/PS1 小鼠在行為學實驗中認知功能的變化

目前用于APP/PS1 小鼠認知能力的行為學實驗方式主要為迷宮實驗，迷宮實驗中常用的檢測裝置有Morris 水迷宮、多臂水迷宮、T-型迷宮、十字迷宮實驗等。實驗中，APP/PS1 小鼠出現認知能力改變的月齡在不同迷宮實驗裝置中檢測結果會有所不同。

1.1 APP/PS1 小鼠出現認知功能改變的月齡 在上述多種迷宮裝置中，Morris 水迷宮是最常用的評價小鼠學習記憶水平的實驗裝置，主要的實驗方法為:定位航行試驗、空間探索試驗分別對轉基因小鼠的空間學習、空間記憶以及長時程記憶能力進行檢測［3］，“逃避潛伏期”是應用最廣泛的評價指標。Jankowsky 的實驗團隊在2005 年的研究表明，8 月齡APP/PS1 小鼠在Morris 水迷宮實驗裝置中已經能夠檢測到認知功能的改變［4］，而后的實驗中，發現雙轉基因小鼠可能于6～8 月齡在Morries 水迷宮中開始出現認知功能改變［5］。而其他的迷宮實驗裝置，尚未能發現小鼠出現行為學改變月齡的規律。如Xiong［6］等則發現6 月齡的雙轉基因鼠在多臂水迷宮中進入錯誤臂的平均次數才開始明顯的多于野生鼠，但OLeary［7］在巴恩斯迷宮中檢測到16 月齡雙轉鼠才與野生鼠明顯的認知功能區別。綜上所述，不同的實驗裝置檢測到雙轉鼠出現認知功能改變的月齡是不同的。即使是同一實驗裝置，可能由于小鼠個體間的差異或實驗方法操作的影響，檢測結果也會有所不同。

1.2 隨著月齡的增加雙轉基因小鼠認知功能的變化FAD 患者的認知功能會隨著病程的延長而不斷下降。故用以模擬AD 病理規律的APP/PS1 雙轉小鼠在行為學實驗中的表現與月齡間也可能存在某種相關性，經過對實驗文獻的總結，在不同的迷宮實驗裝置中月齡與認知功能間的關系主要體現于兩個方面。一是隨著月齡的增加，雙轉基因鼠在迷宮實驗中認知功能損害逐漸加重;二是與野生鼠相比，月齡越大的雙轉基因鼠在行為學實驗中學習記憶能力越差。在Morries 水迷宮實驗裝置中，大部分6～18 月齡區間的雙轉小鼠均可檢測到認知能力呈逐漸下降的趨勢［8，9］。且低月齡(小于等于5月齡)雙轉基因鼠與野生鼠相比經多次訓練后，二者間逃避潛伏期下降趨勢差別很小。而(5 月齡以上)雙轉基因鼠與野生鼠同樣次數的訓練后，其逃避潛伏期反映出明顯的學習記憶能力下降。在其他迷宮實驗裝置，雙轉基因鼠與野生鼠相比逃避潛伏期也反應出相同的趨勢［10，11］。綜上所述，在應用迷宮裝置的行為學實驗中，APP/PS1 雙轉基因小鼠的認知功能與月齡間存在一定的規律，從實驗結果中可看出，隨著月齡的增加，與野生鼠相比APP/PS1 鼠的認知功能受損程度在不斷加重，其學習記憶能力的損害可能最為明顯。

2 不同月齡小鼠腦內Aβ 水平的情況

2.1 Aβ 沉積于APP/PS1 小鼠腦內形成淀粉樣斑塊的實驗檢測 APP/PS1 雙轉基因鼠腦內模擬了Aβ 過量沉積，形成淀粉樣神經炎性斑塊等人類AD 的病理變化。目前常用的APP/PS1 雙轉鼠模型Aβ 檢測指標有，腦內Aβ1-42和Aβ1-40、老年斑等。檢測Aβ 的實驗方法有ELISA 檢測法、硫磺素S(Thioflavin-S)熒光染色檢測法等，前者用于腦組織中的Aβ1-40及Aβ1-42的觀察，后者用于腦內纖維性β-淀粉樣蛋白斑塊的檢測。Jankowsky 認為APP/PS1 小鼠［12］約在6 月齡即可見腦內淀粉樣斑塊沉積，18 月齡時沉積程度最為嚴重。如Garcia［13］使用體內雙光子顯微鏡直接觀察到小鼠在6～7 月齡腦內出現淀粉樣斑塊，并用硫磺素-S 熒光染色法示4 月齡小鼠腦內僅有極少量可檢測的斑塊，斑塊負荷甚至接近0%，6 月齡時斑塊數量約80/ mm2，斑塊負荷約1.7%。且發現同一實驗中6 月齡鼠腦內斑塊數量約為45 塊，8 月齡約為170 塊，12 月齡約為220 塊。平均斑塊面積和負荷也呈逐步上升趨勢。本實驗方法同樣可定位老年斑在小鼠腦內的分布，在APP/PS1 小鼠皮質和海馬中Aβ 淀粉樣沉積所形成的斑塊被染色后顯影最多。低月齡APP/PS1 小鼠腦內Aβ水平與同月齡野生鼠基本相同，約在4 月齡少量沉積，但直到6～7 月齡才能用ELISA 法檢測到。所檢測的Aβ 沉積總量在雙轉基因鼠4～12 月齡內應呈逐漸增加的趨勢［14］由于Aβ 在APP/PS1 小鼠腦內以多種形式存在，可以肯定不可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的總量在腦內的沉積呈增長趨勢，但可溶性Aβ 量的變化則尚無定論。

2.2 Aβ1-40與Aβ1-42隨月齡比值的變化 APP/PS1 小鼠腦內淀粉樣蛋白形成的速率與Aβ1-40∶ Aβ1-42的比率變化直接相關［15］。兩者中增加速度最快的可能與老年斑形成的相關性最大。由于不同實驗中ELISA 檢測采用的勻漿方法、試劑盒等實驗過程千差萬別，因此計算Aβ1-40與Aβ1-42的比值是驗證Aβ 致病性的最好方式。通常認為6 月齡時Aβ1-40∶Aβ1-42通常約為0.75∶ 1。且隨著月齡的增加，Aβ1-40總量∶Aβ1-42總量的比值逐漸應先增大后減小。綜上，APP/PS1 小鼠腦內Aβ 沉積會隨著月齡的增加而加重，選擇6～7 月齡開始檢測APP/PS1 雙轉基因小鼠小鼠腦內Aβ 沉積水平也許為最佳，但也有實驗者對此持相反意見，認為3 月齡開始即可檢測到腦內Aβ 沉積。一般認為Aβ 沉積主要沉積與小鼠腦內的皮質顳側部與海馬［16］。Aβ1-42/1-40比值變化與月齡間可能沒有相關性，該比值可能為Aβ1-42的沉積獨立于Aβ1-40沉積的證據。同時也是判斷Aβ1-40和1-42致病性的最佳指標。

3 小鼠腦內Aβ 情況與認知功能改變相關性評價

3.1 實驗的系統誤差影響認知行為學及Aβ 水平數據系統誤差主要為性別、基因突變造成的表達差異、生長環境等因素。由于AD 發病除了年齡因素外，還有性別、基因突變、教育程度等因素的影響。對于APP/PS1 雙轉基因小鼠模型，因此我們根據AD 的發病過程，期望小鼠能夠在“高齡”時先出現Aβ 過量沉積形成老年斑，再產生行為學改變(學習記憶能力下降，認知功能損害)。但事實上，許多因素影響了APP/PS1 雙轉基因鼠在AD 病理學實驗中的表現。(1)性別，目前普遍認為雄性APP/PS1 鼠在行為學檢測中出現認知功能下降的月齡要晚于相同條件下飼養的雌性，雌性小鼠的Aβ1-40和1-42 水平以及出現的斑塊數量都要高于同月齡的雄性小鼠［17］。這可能是受到性激素的影響出現的結果。(2)小鼠傳代時的基因突變導致后代表達的差異。如腦源性神經營養因子基因(Bndf)，它的表達缺失會是造成APP/PS1 小鼠的過度肥胖，從而造成行為學檢測結果的誤差。并且可以肯定其對ELISA 檢測法的結果有著影響。(3)小鼠飼養環境的因素，2003 年Jankowsky 實驗室探索性的檢測了飼養環境因素對小鼠腦內Aβ 沉積的影響，發現APP/PS1 小鼠在外界刺激豐富的環境下長大比在標準動物房飼養長大腦內Aβ 的沉積量有很大區別。綜上，對于APP/PS1小鼠模型，存在多種外界及自身對實驗造成的系統誤差，這些誤差不可避免的要對小鼠的行為學檢測和腦內Aβ 沉積過程造成影響。

3.2 從不同Aβ 致病理論的角度探究 Aβ 級聯假說作為AD 發病的主要假說，其并未完全闡明Aβ 如何造成認知功能減退，因此學者們提出幾種假說以更深入闡明Aβ 導致認知功能減退的機制。(1)實驗者們認為這是由腦內Aβ 的某種早期聚集形式導致，即“Aβ 寡聚體”。早期月齡Aβ 可溶性寡聚體早于Aβ 沉積形成板塊，產生神經毒性影響突觸功能導致認知功能下降。之后老年斑塊沉積大量出現，此時寡聚體和淀粉樣斑塊共同存在于腦內，產生神經毒性使主宰神經認知功能的神經元、突觸的結構及功能進一步損害。這也可以讓我們從病理學角度解釋為什么一些實驗中小鼠學習記憶能力下降發生早于Aβ 過量沉積形成老年斑。(2)APP/PS1 小鼠個體間行為學檢測結果的差異可能因學習記憶系統的不同方面對Aβ 沉積所產生毒性的敏感度不同。如情景記憶能力比空間參考記憶能力對Aβ1-42的變化更敏感，長期記憶能力則可能受到寡聚體的直接影響。(3)寡聚體誘發的小鼠早期認知功能下降是可逆的，即當飼養過程中小鼠受到外界環境的影響或實驗者的主觀行為對小鼠的行為學實驗進行干預(如故意將模型組在離平臺遠的位置入水)，可能導致認知功能損害出現組間和組內統計學差異。最后，大鼠的Morris 水迷宮任務是由海馬、紋狀體、丘腦、前腦以及小腦等多個腦區共同協調，任何腦區的損害或腦區間聯系的破壞都會影響這一功能的實現。多數以APP/PS1 小鼠模型實驗中，海馬內Aβ 水平和老年斑密度遠超過其他腦區，行為學實驗中長期記憶能力普遍有損害癥狀，這可能是與老年斑產生神經毒性導致海馬內神經突觸損傷有關。綜上，Aβ 與小鼠認知功能下降間的相關性仍然難以準確得出結論。

4 小 結

APP/PS1 轉基因鼠動物模型成功模擬了AD 發病的某些方面，如行為學檢測中認知功能隨月齡的增加而下降，腦內Aβ 沉積隨著月齡的增長而加重。Aβ 可能是AD 神經認知功能損害的始發因子，啟動了神經退行性變，所以APP/PS1 雙轉基因小鼠早期月齡的認知功能改變與Aβ 水平存在相關但非線性關系。但小鼠腦內存在多種形式的Aβ(腦間質液和細胞內的可溶性Aβ、纖維性Aβ、Aβ 寡聚體)。它們對認知功能損害的大小及同步性尚不清楚。且神經炎性斑塊中的Aβ 沉積可能是代謝的副產品，也許神經炎性斑塊的程度和Aβ 水平不能用于神經病理變化程度的評估。轉基因小鼠可用于AD 發病機制研究及療效評估研究。AD 發病與哪個腦區的哪種Aβ 相關尚需要進一步深入研究;選取哪種Aβ 相關指標也是療效評估的關鍵點。

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