紅外光譜結合多元統(tǒng)計分析快速鑒別不同種類牛肝菌

楊天偉，張 霽，史云東，李 濤，王元忠，*，劉鴻高*（1.云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，云南 昆明　65001；.云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明　65000；.玉溪師范學院資源環(huán)境學院，云南 玉溪　65100）

紅外光譜結合多元統(tǒng)計分析快速鑒別不同種類牛肝菌

楊天偉1，2，張 霽2，史云東3，李 濤3，王元忠2，*，劉鴻高1，*
（1.云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，云南 昆明650201；2.云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明650200；3.玉溪師范學院資源環(huán)境學院，云南 玉溪653100）

采用傅里葉變換紅外光譜結合多元統(tǒng)計分析方法快速鑒別不同種類食用牛肝菌。采集10 個不同種類93 個牛 肝菌子實體的紅外光譜，分析食用牛肝菌的紅外光譜特征；用多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標準正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、二階導數(shù)（second derivative，SD）、Norris平滑（ND）、正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）、小波壓縮等方法對光譜進行優(yōu)化處理；經優(yōu)化處理的光譜數(shù)據分別建立馬氏距離分類模型及偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）。結果顯示，牛肝菌在3 325、2 934、2 927、1 637、1 547、1 402、1 375、1 259、1 453、1 081、1 029 cm－1等附近有多個吸收峰，主要歸屬為蛋白質、多糖、氨基酸等的特征吸收峰。MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ ND（15∶5）兩種預處理方式前10 個主成分累積貢獻率分別為95.58%、95.54%，基于兩種預處理方法建立馬氏距離分類模型，驗證集預測準確率分別為90%和95%。PLS-DA結果顯示經MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND （15∶5）預處理不易于區(qū)分牛肝菌種類；原始光譜經正交信號校正及小波壓縮（orthogonal signal correction wavelet compression，OSCW）、優(yōu)化處理并進行PLS-DA分析，能夠很好地區(qū)分不同種類牛肝菌。馬氏距離分類模型不僅能反映樣品的分類情況，同時計算出與測試樣品相似度最大的物種，可為食用菌種類鑒別和未知物種鑒定提供可靠依據；OSCW預處理后進行 PLS-DA分析能有效鑒別不同種類牛肝菌，為野生食用菌的鑒別分類提供一種輔助方法。

紅外光譜；牛肝菌；鑒別；馬氏距離；偏最小二乘判別分析

食用菌營養(yǎng)豐富、食味獨特，是集營養(yǎng)、保健、藥用于一體的健康食品，大量研究表明食用菌富含蛋白質、膳食纖維、多糖、氨基酸、維生素、礦質元素等營養(yǎng)物質［1-4］，可作為人體8 種必需氨基酸和易缺乏微量元素Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Se等的重要來源［3，5-6］；多糖類物質具有抗氧化、防癌抗癌、防病治病、增強人體免疫力等功效［7-9］。我國食用菌種類多、產量大，是世界上最大的食用菌生產國和出口國［10］；云南多樣的立體氣候和豐富的森林資源孕育了大量的野生食用菌資源，牛肝菌、松茸、塊菌等珍稀食用菌深受消費者親睞，已遠銷歐洲、日本等國家，其中牛肝菌成為菌類產品中出口量大、換匯率高的暢銷產品。野生食用菌不與人爭糧，不與農爭時、爭地的特征及人們日益增長的消費需求，市場價格不斷增漲，推動了農民采集野生食用菌的積極性，成為增收的重要來源之一。然而食用菌種類繁多，種間形態(tài)相似性高，不易準確鑒別，因誤食引起的中毒事件時有發(fā)生；市場上出現(xiàn)以假充真、以次充好的現(xiàn)象，甚至有不法商販收購有毒牛肝菌，制成干片后混淆出售，嚴重威脅消費者健康、擾亂食用菌市場。

王向華［11］從云南市場上收購了6 種當?shù)胤Q為“北風菌”的真菌，研究發(fā)現(xiàn)這6 種野生菌中有一類為皂味口蘑（Tricholoma saponaceum （Fr .） Kummer），該菌為有毒真菌不宜食用；食用菌市場上同名異物的“北風菌”僅為一例，其他形態(tài)相似極易混淆物種還大量存在。英國真菌學家Dentinger等［12］報道用超市購買的中國云南出口美味牛肝菌進行DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)同一包裝袋內15 片牛肝菌中有3 種新牛肝菌物種，提出豐富多樣的牛肝菌種類也許對消費者存在安全隱患。這些研究一方面表明真菌的物種多樣性及中國野生食用菌的豐富多樣性，另一方面提示人們準確鑒別不同種類野生食用菌的重要性。

野生食用牛肝菌的準確鑒別是保障消費者安全，深入開發(fā)、研究和市場質量控制的前提基礎。傳統(tǒng)野生食用菌鑒別主要憑借經驗，根據牛肝菌生長特性、外觀型貌、顯微結構、菌肉菌管的顏色及變色反應等進行鑒別分類［13］，該方法受主觀因素干擾較大。目前對食用菌鑒別分類研究主要有光譜法和分子生物學方法，本課題組依據牛肝菌紫外光譜特征結合化學計量學方法研究了牛肝菌不同產地、種類和部位的鑒別方法［14-15］，周在進［13］、時有明［16］等運用傅里葉紅外光譜結合光譜檢索、聚類分析法鑒別了部分食用菌。Feng Bang等［17］通過分析牛肝菌3 個基因片段的DNA系列變異情況，揭示我國牛肝菌物種多樣性；Mello等［18］根據ITS片段設計引物，用分子生物學方法鑒別了銅色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）和美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.）；李艷春等［19］研究了市場上常見4 種牛肝菌的DNA條形碼，結果表明4 種牛肝菌樣品代表了12 個物種；Wu Gang等［20］分析了牛肝菌屬的DNA系列，并結合牛肝菌形態(tài)特征、顯微結構等建立了牛肝菌科分子發(fā)育系統(tǒng)框架；分子生物學方法價格昂貴，操作復雜，不適宜推廣應用。

傅里葉紅外光譜具有操作簡便、樣品量少、分析快速、樣品無損等優(yōu)點［21-22］，已廣泛應用于中藥材產地、物種鑒別［23-24］，食品分析［25-26］，農業(yè)［27］等領域。本研究通過采集10 種野生食用牛肝菌93 個子實體的紅外光譜信息，對原始光譜進行平滑、求導、多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標準正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）等優(yōu)化處理；經優(yōu)化處理的光譜數(shù)據分別建立馬氏距離分類模型及進行偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），為快速鑒別牛肝菌種類提供輔助方法。

1　材料與方法

1.1實驗材料

表1　牛肝菌樣品信息Table 1　Information aboutt Bolleettuuss sampplleess

10 種牛肝菌均于2012年采自云南省玉溪市易門縣，由云南農業(yè)大學劉鴻高教授鑒定，保存于云南農業(yè)大學，詳細信息見表1。

1.2儀器與試劑

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀（采用DTGS檢測器，光譜分辨率為4 cm－1）美國Perkin Elmer公司；YP-2型壓片機上海市山岳科學儀器有限公司；FW-100型高速粉碎機天津市華鑫儀器廠；80 目標準篩盤浙江上虞市道墟五四儀器廠。

KBr（分析純）天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.3方法

1.3.1采集光譜信息

牛肝菌樣品采集后清洗干凈，50 ℃烘干至質量恒定，粉碎，過80 目篩，備用。稱取牛肝菌樣品（1.5±0.2） mg、KBr（1002） mg，在紅外線燈下充分混合研磨，混合均勻的粉末放入模具將其壓成厚度均勻的透明薄片。設定光譜掃描范圍4 000～400 cm－1，累計掃描次數(shù)：16 次，每個樣品測定3 次，取平均光譜。樣品1#重復稱取7 份，分別壓片測定，考察重復性，取同一片樣品重復測定7 次，考察方法精密度，取同一片樣品分別在0、10、20、30、40、50、60 min時測定（每次測完立即放到紅外線燈下，以防吸水），考察穩(wěn)定性。實驗過程中時時扣除背景干擾。

1.3.2光譜優(yōu)化處理和數(shù)據分析

光譜數(shù)據采集時受儀器噪音、樣品差異、環(huán)境等諸多因素影響；對原始光譜進行優(yōu)化處理，可以降低或消除噪音、背景等的干擾，提高光譜分析的精度。常用的光譜預處理方法主要有平滑、求導、MSC、SNV、OSC等，這些方法各具優(yōu)點，如光譜平滑能減弱噪音干擾，光譜數(shù)據進行求導可以消除基線漂移和噪音干擾，MSC可減小散射光帶來的誤差，OSC能有效去除與目標變量無關的干擾信息，提高光譜分析的準確度［28-29］。優(yōu)化處理后的紅外光譜數(shù)據分別建立馬氏距離判別分類模型和進行PLS-DA分析。

2　結果與分析

2.1實驗方法學考察

運用Omnic 8.2軟件的光譜檢索功能，建立重復性、精密度、穩(wěn)定性的光譜數(shù)據庫：A1、A2、A3，分別計算用于方法學考察樣品的匹配分值，匹配分值越大方法越可靠［13］。結果顯示重復性、精密度、穩(wěn)定性的匹配值分別在99.42%～99.93%、99.90%～99.99%、99.21%～99.97%之間，表明方法穩(wěn)定性好，精密度高。

2.2不同種類牛肝菌紅外光譜分析

圖 1　不同種類牛肝菌平均紅外光譜Fig.1　Mean FTIR spectra of different species of boletus

由圖1可看出，不同種類牛肝菌紅外光譜的峰形、峰位基本一致，而峰高（吸光度）等具有差異，表明不同種類牛肝菌的化學組分基本相同，而對化學成分的積累量不同。牛肝菌在3 325 cm－1附近的強吸收峰歸屬為蛋白質、多糖、纖維素等的O—H伸縮振動和蛋白質中的N—H伸縮振動；2 934、2 927 cm－1附近明顯的吸收峰主要為多糖、蛋白質等甲基的對稱伸縮振動；1 637 cm－1附近吸收峰歸屬為蛋白質酰胺Ⅰ帶和C=O伸縮振動；1 547 cm－1附近為蛋白質C=N、N—H的伸縮振動；1 453 cm－1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動；1 402、1 375、1 259 cm－1等附近為多糖、蛋白質等的C—O—H彎曲振動和亞甲基的變形振動；1 081、1 029 cm－1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動；950～710 cm－1范圍多個弱吸收峰，主要為糖類異構體的特征峰。

2.3光譜預處理

運用TQ8.0軟件對原始光譜進行平滑、求導、MSC、SNV等優(yōu)化處理，運用SIMCA-P10.0軟件對原始光譜進行SNV-小波壓縮優(yōu)化處理，以減弱噪音、散射光、基線漂移等的干擾，提高光譜分析的準確度，結果見圖1和表2、3。

表2　不同預處理方法的主成分累積貢獻率Table 2 Principal component cumulative contribution rates of different pretreatment methods

由圖1和表2可知，MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+ SD+ND（15∶5）兩種光譜優(yōu)化方法，前10個主成分的累積貢獻率均大于95%，效果較好。表3顯示了正交信號校正及小波壓縮（orthogonal signal correction wavelet compression，OSCW）預處理的參數(shù)，OSCW選取了特征值大于1的3 個主成分，選用多貝西小波函數(shù)和離散小波變換法進行壓縮；結果顯示，第3主成分的剩余平方和為26.07%，表明與牛肝菌分類變量無關的73.93%干擾信息已被消除。

表 3 OSCW預處理結果Table 3　Results of OSCW pretreatment

2.4不同種類牛肝菌馬氏距離分類模型

隨機選取20 個樣品為驗證集，其余樣品為訓練集，將10 種不同牛肝菌種類定義為1～10類；用TQ8.0軟件選擇MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）兩種光譜優(yōu)化方法建立不同種類牛肝菌的馬氏距離分類判別模型，結果見表4。由表4可知，基于MSC+SD+ND （15∶5）光譜優(yōu)化處理方法建立的分類模型，20 個驗證集中9#和67#樣品分類錯誤，其余樣品分類正確，樣品分類預測正確率為90%；經SNV+SD+ND（15∶5）光譜 預處理建立 的模型，只有9#樣品分類錯誤，其余樣品分類正確，預測正確率達95%。

表4不僅顯示了20 個驗證集樣品的分類結果，驗證集樣品的計算類別與真實類別之間的馬氏距離，還計算出驗證集樣品與下一個最接近類別的馬氏距離，能反映兩類樣品的相似性。例如2#樣品真實類別為第1類（華麗牛肝菌），計算結果也為第1類，表明2#樣品分類正確，2#樣品到真實分類的馬氏距離為0.811；除真實值外與2#樣品最近的類別為第4類，馬氏距離為1.088，表明2#（第1類）樣品與第4類樣品的相似度較大，可以推測兩類牛肝菌樣品化學組分及含量相似。MSC+SD+ND （15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）兩種預處理方法建立的馬氏距離分類模型結果基本一致，如23#樣品計算分類到真實分類的距離及與最接近類別的距離最大，53#樣品馬氏距離最小。

表4　牛肝菌種類馬氏距離分類模型預測結果Table 4 Prediction results for boletus classififi cation by the Mahalanobisdistance classififi cation model

2.5PLS-DA

將MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND （15∶5）預處理后的光譜數(shù)據導入SIMCA-P軟件進行PLS-DA，結果見圖2。圖2為前3 個主成分的三維得分圖，由圖2a可看出，不同種類牛肝菌樣品只有部分樣品可以很好的聚類，很多樣品出現(xiàn)離散分布，不易區(qū)分不同種類牛肝菌樣品，圖2b反映出不同種類牛肝菌分類效果明顯優(yōu)于圖2a的分類效果，但部分樣品的聚類效果不明顯如：磚紅絨蓋牛肝菌；不同種類牛肝菌樣品互相堆疊，難以鑒別牛肝菌種類，表明SNV+SD+ND（15 ∶5）和MSC+SD+ND（15∶5）光譜預處理方法結合PLS-DA分析不適宜用于牛肝菌種類鑒別。

圖 22 MMSSCC+SSDD+NNDD（　1155∶5）（a）和SSNNVV+SSDD+NNDD（1155∶55）（bb）預處理后PLS-DA分析的三維得分圖Fig.2　3D score plot of PLS-DA after MSC + SD + ND （15∶5） （a） and SNV + SD + ND （15∶5） （b） pretreatment

圖3　OSCW預處理后PLS-DA分析的三維得分圖Fig.3　3D score plot of PLS-DA after OSCW pretreatment

OSCW預處理后的光譜數(shù)據進行PLS-DA分析，結果見圖3，基于OSCW建立的PLS-DA分類模型能夠很好地將不同種類牛肝菌樣品區(qū)分開，可用于不同種類牛肝菌的鑒別分析。圖中9#樣品與該類（華麗牛肝菌）其他樣品的距離較遠，結果與馬氏距離分類判別模型中9#樣品分類錯誤的結果一致。與圖2相比，OSCW紅外光譜預處理方法能夠更有效地去除與分類變量無關的信息，保留有用信息，為不同種類牛肝菌的鑒別分析提供更可靠的依據。

3　結 論

采用傅里葉變換紅外光譜法測定了10 種牛肝菌的紅外光譜，根據牛肝菌的紅外吸收峰分析其成分特征。應用平滑、求導、MSC、SNV、OSC-小波壓縮等方法對原始光譜進行優(yōu)化處理。結果顯示MSC+SD+ND （15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）兩種預處理方法前10 個主成分累積貢獻率均在95%以上，OSCW預處理方法能有效去除與牛肝菌種類無關的干擾信息提高光譜分析的準確度。

基于MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND （15∶5）預處理方法建立馬氏距離分類判別模型，驗證集樣品的預測正確率分別為90%和95%，得到滿意的結果。馬氏距離分類模型不僅可以預測牛肝菌分類結果，而且可以看出與某一牛肝菌樣品最相近的種類及到該種類的馬氏距離，此方法可為牛肝菌等食藥用真菌的物種鑒定、鑒別提供科學依據。經預處理后的光譜數(shù)據分別進行PLS-DA分析，結果顯示，用MSC+SD+ND （15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）預處理結合PLS-DA分析，不能有效區(qū)分牛肝菌種類，不適宜牛肝菌種類鑒別分類；OSCW預處理后的光譜數(shù)據進行PLS-DA分析，能夠明顯區(qū)分不同種類牛肝菌樣品，結果滿意，可用于野生食用菌種類鑒別分析。

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Infrared Spectroscopy Combined with Multivariate Statistical Analysis to Quickly Identify Different Species of Bolete Mushrooms

YANG Tianwei1， 2， ZHANG Ji2， SHI Yundong3， LI Tao3， WANG Yuanzhong2，*， LIU Honggao1，*
（1. College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming650201， China；2. Institute of Medicinal Plants， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming650200， China；3. College of Resources and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi653100， China）

Fourier transform infrared spectroscopy combined with multivariate statistical analysis was used to establish a rapid method for the identifi cation of different species of edible bolete mushrooms. The infrared spectral characteristics of 93 bolete samples of 10 different species were analyzed. The original infrared spectra were pretreated by multiplicative signal correction （MSC）， standard normal variate （SNV）， second derivative， Norris smooth， orthogonal signal correction （OSC） and wavelet compression. The optimized spectral data were used to establish a mahalanobis distance classifi cation model and a partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） model. The results showed that the characteristic absorption peaks of protein， polysaccharide and amino acid appeared at wavenubmers around 3 325， 2 934， 2 927， 1 637， 1 547， 1 402， 1 375，1 259， 1 453， 1 081， and 1 029 cm-1. The cumulative contribution rates were 95.58% and 95.54% in t he PLS-DA model based on MSC + SD + ND （15：5） and SNV + SD + ND （15：5） pretreatment， respectively. The Mahalanobis distance classification model was established base on the two pretreatment m ethods and the prediction accuracies of validation

set were 90% and 95% respectively. Bolete species could not be well distinguished by the PLS-DA model， when the data were pretreated by the MSC + SD + ND （15：5） and SNV + SD + ND （15：5）. PLS-DA analysis of the original spectra after optimization with orthogonal signal correction wavelet compression （OSCW） could distinguish different species of boletes. The Mahalanobis distance classification model could reflect the classification of the samples and compute the greatest similarity with the tested species， which can provide a reliable basis for the classifi cation of edible mushrooms and for the identifi cation of unknown species. OSCW pretreatment combined with PLS-DA analysis can effectively identify different species of boletes， providing an auxiliary method for the identifi cation of wild edible mushrooms.

infrared spectroscopy； boletes； discrimination； Mahalanobis distance； partial least squares discriminant analysis （PLS-DA）

2015-01-21

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31260496；31160409；31460538）；國務院農村綜合改革專項（2014NG007-18）；云南省教育廳科學研究基金項目（2013Z074）

楊天偉（1989—），男，碩士研究生，主要從事野生食用菌資源研究。E-mail：yangtianweizj@126.com

王元忠（1981—），男，助理研究員，碩士，主要從事藥用植物和真菌資源研究。E-mail：yzwang1981@126.com

劉鴻高（1974—），男，教授，博士研究生，主要從事野生食用菌資源研究。E-mail：honggaoliu@126.com

TS201.2

A

1002-6630（2015）24-0116-06

10.7506/spkx1002-6630-201524020