志賀氏菌標準物質的制備方法

柯 璐，戴曉麗，林 杰*，黃嫦嬌，曾維揚，張溫玲

（福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州　　350003）

志賀氏菌標準物質的制備方法

柯 璐，戴曉麗，林 杰*，黃嫦嬌，曾維揚，張溫玲

（福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州350003）

采用冷凍干燥法制備標準物質。通過正交試驗法選擇凍干保護率最高的保護劑配方方案。以雞肉粉作為標準物質基質，按比例與保護劑配方混合，添加擬定菌數的新鮮菌液后進行冷凍干燥。實驗制備的標準物質樣品其特性值（含菌數）為530 CFU/瓶，不確定度為24 CFU/瓶。冷凍干燥樣品在－20 ℃及4 ℃條件下保存12 個月，特性值穩定；25 ℃條件下保存9 個月，特性值穩定；60 ℃條件下保存，穩定性差。

宋氏志賀氏菌；標準物質；基質；雞肉

志賀氏菌（Shigella）是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，廣泛存在于各種食品中。人類對志賀氏菌的易感性較高，所以在食物和飲用水的衛生檢驗時，常以志賀氏菌作為指標［1-2］。目前GB 4789.5—2012《食品微生物學檢驗：志賀氏菌檢驗》是對食品中志賀氏菌的定性檢測方法，在1988年，國際食品微生物標準委員會指出，定量是微生物風險評估最理想的方式，因其方便風險管理政策的制定，食品中致病微生物的檢測也正逐步從定性檢測向定量檢測發展［3-4］。通過使用菌種標準物質能夠有效保證定量檢測高效、準確地運行，菌種標準物質是生物特性標準物質中較為特殊的一類，國內僅在出入境檢驗檢疫系統內少數幾個局在研制，大部分的標準物質都是靠國外引進。2006年，遼寧出入境檢驗檢疫局所研制的食品中微生物菌落總數標準物質被批準為國家二級標準物質。該標準物質包含兩種研制方法：一種是以模擬食品實物，添加腸桿菌、沙雷氏菌、芽孢桿菌等具有標準號、可溯源性的菌株經冷凍干燥制成的：另一種是以魚粉為基質與上述細菌混合經冷凍干燥制成的，而我國在食品基質的食源性致病微生物標準物質領域仍是空白，因此研制添加基質的志賀氏菌定量標準物質有重要意義［5-9］。本實驗以宋氏志賀氏菌為目標菌，添加無菌雞肉粉，配合凍干保護劑通過冷凍干燥法研制含一定菌數的宋氏志賀氏菌標準物質，并評估不確定度以及對特性值進行均勻性檢測和穩定性追蹤。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

菌源：宋氏志賀氏菌Shigella sonnei，ATCC25931購自上海漢尼公司；基質：雞胸脯肉購自福建圣農集團，低溫運輸。－20 ℃儲存備用；志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、志賀氏菌顯色培養基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、菌落計數瓊脂北京陸橋有限公司；蔗糖（分析純）上海試一化學劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（優級純）國藥集團化學試劑有限公司；酪氨酸（優級純）上海百賽生物技術有限公司；德運脫脂牛奶富祺仕貿易（上海）有限公司。

1.2儀器與設備

KD-TBC-300M電子天平福建科迪技術有限公司；MODULYO-4K冷凍干燥機（配有真空泵）美國Edword公司；FW100高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；M37610-33振蕩器金華雷琪實驗器材有限公司；Stomacher3500拍擊式均質器英國Seward公司；SpectraMax M5多功能酶標儀美國Molecular Devices公司；SHKE4450臺式恒溫振蕩器美國Thermo公司；VXE380超低溫冰箱法國Jouan公司；Vitek2COMPACT30微生物鑒定儀（配套GP鑒定卡）法國生物梅里埃公司；BOX389微生物鑒定儀配套麥氏比濁儀美國Hach公司；5 mL西林瓶（配套丁基膠塞）安徽華欣藥用玻璃制品有限公司。

1.3方法

1.3.1制備保存液

標準菌株凍干粉用志賀氏菌增菌肉湯溶解后劃線接種于志賀氏菌顯色培養基，（36±1） ℃培養20～48 h，挑取單菌落接種100 mL志賀氏菌增菌肉湯中，（41.5±1）℃培養16～20 h。吸取400 μL新鮮菌液（OD600 nm=0.264）于無菌1.5 mL聚乙烯離心管，再吸取600 μL 40%無菌甘油與之混合，即為保存液。保存液平均菌數為4.3×107CFU/mL。保存在－20 ℃備用，使用前恢復室溫（22 ℃）后渦旋10 s。

1.3.2菌液OD600 nm值對應的菌數范圍

加保存液2 μL于200 mL志賀氏菌增菌肉湯增菌液，設計10 個平行，（41.5±1） ℃培養8、12、16、18 h，利用多功能酶標儀測定培養液的OD600 nm值，同時按照GB 4789.2—2010《動物源性食品中抗生素類藥物殘留檢測方法：微生物抑制法》進行菌落計數［10］。

1.3.3基質的前處理

雞肉（無抗生素殘留）剔除脂肪組織（因動物脂肪較易氧化酸敗，使得干粉質量下降，保存狀態不穩定，因此盡量剔除脂肪），冷凍干燥后脫水率為73.029%。脫水雞肉用高速萬能粉碎機粉碎，基質組織細度為170 目，疏松粉末狀，易分散于熱水中，有少量的沉淀。60Co γ輻射劑量選擇6 kGy，滅菌后分裝于自封袋中，100 g/袋，于玻璃干燥鍋儲存待用［11-12］。

1.3.4保護劑的設計

4 個因素脫脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸分別記作M、P、S、T，水平設計見表1。選用L9（34）正交表安排試驗，結果見表2。每種保護劑配方液加入體積為1%的新鮮菌液（OD600 nm=0.215），于臺式恒溫振蕩器上混勻（300 r/min，30 min），分別按2 mL/瓶分裝無菌西林瓶，冷凍干燥參數見表3。以保護率為指標選出保護率最高的保護劑配方。保護率（B1）計算公式：

式中：C1為凍干前菌數/（CFU/mL）；C2為凍干后菌數/（CFU/mL）。

表1　單因素水平設計Taabbllee 11 　　FFaaccttoorrss aanndd tthheeiirr ccooddeedd lleevveellss uusseedd iinn oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy ddeessiiggnn

注：純水、S、M的體積分別記作：N1、N2、N3；2％（N2+N3）代表添加體積為蔗糖和脫脂乳體積的2％，其余計算方式一致。

表2　保護劑正交試驗設計Table 2　Orthogonal array design scheme for lyoprotectant formulationsTable 2　Orthogonal array design scheme for lyoprotectant formulations

表3　　凍干參數設計Table 3　　Parameter settings of lyophilizer

1.3.5混懸液的配制

基質與無菌水混合后稱為基質懸液，基質懸液與配方保護劑混合后稱為混懸液，根據基質脫水率（估為75%），設計混懸液的配制方案見表4。新鮮菌液（OD600 nm=0.270）按體積1%添加至混懸液，于臺式恒溫振蕩器上搖勻（300 r/min，30 min），2 mL/瓶分裝西林瓶。凍干程序參數見表5。根據混懸液保護率B2（計算參見公式（1））選擇最優配制方式。

凍干后樣品復原方法：樣品于室溫（22 ℃）條件下放置10 min，加2 mL生理鹽水渦旋10 s，靜置10 min。

表 4　　混懸液的配制設計Table 4　　Volume proportions of mixed suspensions

表5　　凍干參數設計Table 5　　Parameter settings of lyophilizer

1.3.6混懸液含菌數的確定

1.3.6.1凍干樣品含菌數短期下降率

按照1.3.5節結果選擇的最優混懸液配制方式配制100 mL混懸液，根據保護率B2及新鮮菌液含菌數，設計混懸液含菌數（添加1%體積的菌液）。充分混勻后2 mL/瓶分裝西林瓶，凍干參數見表5。

凍干后樣品于－20 ℃條件保存，于0、7、14、28、40 d時取出計數，按式（2）計算凍干樣品菌數的短期下降率（Xn）。

式中：C0為凍干后當日菌數/（CFU/瓶）；Cn為－70 ℃條件下儲存n d后的菌數/（CFU/瓶）；Xn為第n天菌數下降率/%。

1.3.6.2混懸液菌數的確定

標準物質含菌數預期值為：200～600 CFU/瓶（即100～300 CFU/mL）。根據保護率B2及X40，按式（3）、（4）計算混懸液最小含菌數Y1、最大含菌數Y2：

式中：Y1為最小含菌數/（CFU/mL）；Y2為最大含菌數/（CFU/mL）；B2為保護率/%；X40為第40天菌數下降率/%。

則在添加新鮮菌液時應保證Y1≤混懸液含菌數≤Y2。

1.3.7批量制備標準物質凍干樣品

按照上述工藝流程制備6 個批次，每批次100 個樣品，共計540 個樣品，批次編號為：SH1～SH6。固定鋁蓋后存于－20 ℃待測。

1.3.8志賀氏菌的驗證

對制備后的凍干樣品利用VITEK2程序進行志賀氏菌的鑒定。

1.3.9均勻性驗證

按隨機表抽樣，每批樣品抽取15 瓶，在控制同樣實驗條件下進行檢測樣品的含菌數（CFU/瓶），對結果進行方差分析［17-20］。

1.3.10凍干樣品的定值

定值結果表示為：標準值±總不確定度。標準值參考1.3.8節結果。

1.3.10.1菌落總數計數方法的不確定度評估

新鮮培養菌液，根據OD600 nm值，估計濃度約為2.0×108～3.0×108CFU/mL，稀釋至適當濃度，吸取1 mL于平板計數，平行2 次，以結果的對數值進行驗證，用合并樣本標準差來評估計數帶來的不確定度。

1.3.10.2樣品定值方法不確定度評估

按隨機表取樣品15 份，每份樣品平行測量2 次，用結果的對數值進行驗證。

1.3.10.3電子天平及移液器的不確定度評估

參照文獻［21-24］及校準所依據的技術規范JJG 646—2006《移液器檢定規程》［25］、JJG 1036—2008《電子天平檢定規程》［26］。

1.3.11凍干樣品穩定性統計檢驗

樣品儲存在－20、4、25 ℃，在0、1、6、9、12 個月時，分別取出6 瓶進行分析。

對于運輸過程的特殊溫度，設計為60 ℃，保存第0、3、5、7、10天時，分別取出6 瓶進行分析。

2　　結果與分析

2.1菌液OD600 nm值及對應的菌數范圍

將蜂蜜樣品置于40 ℃數顯恒溫水浴鍋中加熱20 min，過200目篩除去蜂蜜樣品中不溶性的雜質，真空脫氣。

表 66 　OODD60000 nnmm值對應的菌數Table 66 　　OODD60000 nnmmvalue corresponding to the bacterial density

對新鮮菌液進行OD600 nm值檢測，根據OD600 nm值參考表6評估菌液的含菌數以方便實驗安排。

2.2保護劑正交試驗結果

表7顯示，7號保護劑配方的B1最高，為32.39%，標準差為0.074%，選擇該保護劑配方作為凍干保護劑。

表7　正交試驗結果Taabbllee 77 　　RReessuullttss ooff oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy ddeessiiggnn eexxppeerriimmeennttss %

2.3混懸液的保護率

表 8　混懸液的保護率Taabbllee 88 　　　PPrrootteeccttiioonn eeffffi i cciieennccyy ooff bbaacctteerriiaall ssuussppeennssiioonnss %

由表8可知，9號配制混懸液B2為36.67%，標準差為0.048%，選用9號方案配制混懸液。

2.4混懸液菌數短期下降率

根據B2為36.67%和新鮮菌液含菌數（4.0×108～5.0×108CFU/mL），設計混懸液菌數水平見表9。

表 99 　混懸液菌數設計Table 9　Design of mixed suspension concentrations

根據表9配制混懸液后，每種分裝2 mL/瓶，按照表5參數進行凍干。凍干樣品含菌數檢測結果見表10。

表 10　混懸液菌數測定Taabbllee 1100 　　BBaacctteerriiaa ccoouunnttss ooff mmiixxeedd ssuussppeennssiioonnss dduurriinngg ssttoorraaggee CFU/瓶

表 11　混懸液在不同保存時間的菌數下降率TTaabbllee 1111 　　DDeecclliinneess iinn bbaacctteerriiaa ccoouunnttss ooff mmiixxeedd ssuussppeennssiioonnss aatt different storage timmeess %

由表11可知，高、中、低菌數的樣品凍干后菌數從第14～40天相對穩定，計算X40的平均值為67.66%。將值帶入公式（3）、（4），計算得混懸液的菌數應在8.4×102～2.5×103CFU/mL范圍內。

2.5志賀氏菌驗證

VITEK2生化鑒定結果是97%為Shigella sonnei，結果判定為Excellent identifi ation。

2.6均勻性驗證

樣品于制備完成的第40天在同一實驗條件下進行檢測。6 個批次記為：m1～m6，每批次抽取15個樣品，記為：n1～n15，檢測結果見表12。

表 12　樣品的含菌數Table 12　The bacterial counts in real samplesCFU/瓶

該統計量是自由度（v1，v2）的F分布變量。根據自由度及給定的顯著性水平α=0.05，查得：F=2.19＜Fα= 2.201，則組內和組間無顯著性差異，即樣品均勻。

2.7凍干樣品的定值

2.7.1凍干樣品的標準值

樣品的標準值采用均勻性實驗的計數結果，即標準值為530 CFU/瓶。

2.7.2樣品的不確定度評估

2.7.2.1菌落計數方法不確定度的評估結果

表 13　計數方法不確定度的檢測結果TTaabbllee 1133 　　UUnncceerrttaaiinnttyy aarriissiinngg ffrroomm bbaacctteerriiaall ccoouunnttiinngg mmeetthhoodd

根據貝塞爾計算公式，計算出檢測結果對數值標準偏差合并樣本的標準差Sp，以評估計數方法帶來的不確定度。

根據公式：vi=lgXi－計算每個樣品檢測結果的殘差值vi，并進一步計算殘差平方vi2及殘差平方和Σvi2，計算結果見表14。

表 14　　檢測結果的殘差平方及殘差平方和Table 14　　residual squares and their sum

根據貝塞爾計算公式，可計算出檢測結果對數值標準偏差合并樣本的標準差：

式中：m為檢測的樣本數，即m=10；n為每個樣品重復檢測的次數，即n=2。

當檢測結果以2 次測量數據的對數值的平均值表示時，其值區間分布于±0.021之間。由于菌數最小基數為1，因此該不確定度可忽略不計。

2.7.2.2標準物質定值的不確定度評估結果

取不同批次的凍干標準物質10 份（于－70 ℃儲存40 d的樣品），每份樣品平行測量2 次，計數結果見表15。為運算方便，數值不采用科學計數法表示。

表 15　定值方法不確定度的計數結果Taabbllee 1155 　　BBaacctteerriiaall ccoouunnttss aanndd uunncceerrttaaiinnttyy ccaallccuullaattiioonnss iinn cceerrttiiffi i ccaattiioonn of reference materiaallss

式中：m為檢測的樣本數，即m=10；n為每個樣品重復檢測的次數，即n=2，則標準偏差合并樣本樣品標準差：Sp=15.165 750 89 CFU/瓶，則總體合成的樣本差10.723 805 29 CFU/瓶。取置信水平95%， f（自由度）=10，經過查t分布表得：t0.05（10）=2.228，擴展不確定度：U2=t×Uc=2.228×10.723 805 29= 23.892 638 2 CFU/瓶，取整數則U=24 CFU/瓶。

當測量檢驗結果用2 次測量值平均值表示結果時，其值分布區間至±24 CFU/瓶之間。這個取值的區間適用于每一次測量。

2.7.2.3移液器和電子天平的不確定度

移液器本次校準容量相對誤差測量結果的擴展不確定度：U=0.1%（k=2）；電子天平擴展不確定度U=2.793 4 mg。在本標準物質定值中移液器和電子天平的不確定度可忽略不計。

2.8樣品的穩定性

樣品儲存在－20、4、25 ℃，每個時間取6 瓶檢測，以平均值作為檢測數值，結果見表16。

表 16　凍干樣品的穩定性測量數據Taabbllee 1166 　　BBaacctteerriiaall ccoouunnttss ooff tthhee ffrreeeezzee--ddrriieedd ssaammpplleess dduurriinngg ssttoorraaggee at different temperaturreess

表16顯示，保存第1個月，由于冷凍干燥后，樣品性狀不穩定，細菌對環境溫度的變化敏感，樣品含菌數下降幅度大，因此除去第0個月數值，以x代表時間，y代表凍干樣品的特性值（菌含量），擬合成一條直線，－20、4、25 ℃斜率分別記為b1、b2、b3。以－20 ℃為例，計算如下：

b0=－b1=548.56

直線的標準偏差s2：

取其平方根s=31.35，斜率的不確定度s（b1）計算：

自由度為n－2，p=0.95（95%置信水平），則t=4.30。

由于|b1|=5.15＜t0.95（n－2）×s（b1）=6.73，故斜率是不顯著的，因而樣品在－20 ℃保存第1～12個月未觀測到不穩定性。

表17結果顯示，樣品在4 ℃保存第1～12個月未觀測到不穩定性。在25 ℃保存第1～9個月未觀測到不穩定性。由表18結果顯示，樣品在運輸的特殊溫度60 ℃條件下，保存第10天，下降率高達84.38%，穩定性差［27］。表 17凍干樣品的穩定性TTaabbllee 1177 SSttaabbiilliittyy aannaallyyssiiss ooff tthhee ffrreeeezzee--ddrriieedd ssaammpplleess

時間/ 月t值（自由度為n－2，p=0.95）4 ℃保存穩定性分析25 ℃保存穩定性分析169 12.71　|b3|=14.69＜t0.95（n－2）×s（b3）=19.06 12　4.30　|b2|=11.82＜t0.95（n－2）×s（b2）=12.87|b3|=14.09＞t0.95（n－2）×s（b3）=4.89

表 18　60 ℃保存的短期穩定性Taabbllee 1188 　　SSttaabbiilliittyy ooff tthhee ffrreeeezzee--ddrriieedd ssaammpplleess ssttoorreedd aatt 6600 ℃

3　　結 論

3.1凍干配方保護劑的配制方案

通過正交試驗獲得配方保護劑的配制最佳方案：設定純水體積為N1，蔗糖體積為N2=N1，脫脂奶體積為N3=4N2，聚乙烯吡咯烷酮和酪氨酸的體積分別為2%（N2+ N3）和4%（N2+N3）。其凍干保護率為32.39%，相對高，為獲得更高的保護效果還需進一步研究各因素水平的設計以及混合比例的安排。

3.2混懸液的配制方案

以凍干后保護率為指標獲得混懸液的最佳配制方案：基質與無菌水按1 g/7 mL的比例配制后再與配方保護劑按1∶3的體積比混勻，加入體積為1%的新鮮菌液（菌液用無菌生理鹽水稀釋使得混懸液的含菌數在8.4×102～2.5×103CFU/mL。其保護率為36.67%，－20 ℃保存40 d時菌數下降率為67.66%。

3.3穩定性跟蹤

追蹤樣品保存于－20、4 ℃以及25 ℃條件下12 個月的特性值穩定性，其－20 ℃和4 ℃保存條件下12 個月未觀測到不穩定性，25 ℃保存9 個月穩定性良好，60 ℃的短期穩定性差。冷凍干燥過程對細菌的損傷大，凍干后的存活細菌中有一部分已被損傷，而凍干后的環境只具備基本存活條件，使得細菌處于休眠狀態，損傷菌未能獲得營養進行修復，因此在短期內死亡率大。

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Preparation of Reference Materials for Shigella

KE Lu， DAI Xiaoli， LIN Jie*， HUANG Changjiao， ZENG Weiyang， ZHANG Wenling
（Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research， Center of Technology，Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou350003， China）

This study aimed to prepare reference materials for Shigella by a freeze-drying method. Orthogonal array design was applied to choose the optimal formulation of lyoprotectant that provided maximum protection effi ciency. Chicken powder was used as the substrate for reference materials， which was mixed proportionally with the lyoprotectant and freeze-dried after addition of the fresh bacterial solution with a predetermined number of cells. The reference materials had a characteristic value （bacterial count） of 530 CFU/bottle with an uncertainty of 24 CFU/bottle. At -20 and 4 ℃ the freeze-dried samples could be stored for 12 months with good stability of the characteristic value. At 25 ℃，the storage life of the freeze-dried samples was 9 months， during which the characteristic value remained stable. However， at 60 ℃， the stability was poor.

Shigella sonnei； reference materials； matrix； chicken

TS207.4

A

1002-6630（2015）24-0253-07

10.7506/spkx1002-6630-201524047

2015-06-23

福建出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（FK2013-22）

柯璐（1987—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物及動物毒理學研究。E-mail：15980216539@163.com

林杰（1968—），男，高級工程師，本科，主要從事食品微生物研究。E-mail：lj19102102@sina.com