超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定木瓜中聯苯肼酯及其代謝產物

張 月，韓丙軍，趙方方（中國熱帶農業科學院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南 海口　5711 01）

超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定木瓜中聯苯肼酯及其代謝產物

張 月，韓丙軍，趙方方
（中國熱帶農業科學院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南 海口5711 01）

建立木瓜中聯苯肼酯及其代謝產物聯苯肼酯烯的超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜分析方法。樣品用乙腈和0.25%乙酸溶液勻漿提取，鹽析，分取上清液，同時加入0.25%抗壞血酸溶液于離心管中，衍生60 min后待測。目標化合物經Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，采用三重四極桿串聯質譜多反應監測模式進行定性定量分析。結果表明，在1.0～10.0 ng/kg添加量時，聯苯肼酯及聯苯肼酯烯的回收率分別為86.2%～109.8%和78.3%～97.3%，相對標準偏差分別為4.0%～7.0%和4.5%～8.8%（n=5）。方法的 線性范圍為0.25～2.0 ng/m L，相 關系數（r）為0.99 9 8。該方法對聯苯肼酯的定量限均為1×10－6mg/kg，能滿足木瓜中聯苯肼酯的殘留檢測要求。

超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜；木瓜；聯苯肼酯；聯苯肼酯烯；殘留

聯苯肼酯是聯苯肼類殺螨劑，是一種新型選 擇性殺螨劑。其純品外觀為白色固體結晶。美國科聚亞公司2008年在我國獲得登記。其作用機理為對螨類的中樞神經傳導系統的γ-氨基丁酸受體的獨特作用，也有研究表明聯苯肼酯作用于螨類線粒體，抑制細胞色素bQo位點復合物Ⅲ的合成，具有殺卵活性和對成螨的擊倒活性，且持效期長［1-8］。主要用于果樹、棉花、蔬菜和茶葉上害螨的防治［9］，很多國家和地區在不同作物上均制定了不同的殘留限量標準，其中美國［10］為0.05～15 mg/kg，加拿大［10］為0.01～1.5 mg/kg，澳大利亞［10］為0.01～2 mg/kg，歐盟［11］為0.01～2 mg/kg，日本［12］為0.01～10 mg/kg。根據2006年聯合國糧農組織及世界衛生組織農藥殘留聯合專家會議報告［13］中 的殘留定義為聯苯肼酯及其代謝產物聯苯肼酯烯之和，聯苯肼酯烯以聯苯肼酯計，因此檢測聯苯肼酯及其代謝產物具有重要的意義。

近年來有關聯苯肼酯的文獻報道大多是關于牛奶、葡萄酒、干花、濃縮果蔬汁、草莓、柑橘等中聯苯肼酯的殘留分析研究［14-20］。曹巍等［21］采用高效液相色譜分析聯苯肼酯原藥，肖崢［22］、張燕［23］等采用高效液相色譜法對聯苯肼酯懸浮劑含量的測定，未見其在木瓜中殘留檢測的報道。本實驗采用超高效液相色譜-串聯質譜電噴霧正離子模式檢測，建立了木瓜中 聯苯肼酯及其代謝產物聯苯肼酯烯的殘留檢測，結果滿足農藥殘留檢測的要求［24］。

1　　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

木瓜鮮果，采于海南省臨高縣國營紅華農場，樣品采集時間為2014年7月，樣品分裝后在－20 ℃冷凍貯藏。

聯苯肼酯及聯苯肼酯烯標準品（純度≥99%）農業部環境質量監督檢驗測試中心（天津）；乙腈（色譜極）美國Fisher公司；抗壞血酸、乙酸（分析純）廣州化學試劑廠。

超高效液相色譜儀美國Waters公司；API4000+三重四極桿質譜儀美國AB公司；IKAT25勻漿機上海萬捷科技有限公司；HH-6恒溫水浴鍋常州賽普實驗儀器廠。

1.2方法

1.2.1標準溶液的配制

標準溶液：分別準確稱取0.050 g（精確至0.001 g）聯苯肼酯及聯苯肼酯烯標準品于2 個50 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，得到1 000 μg/mL標準儲備液，于－18 ℃保存。

基質標準溶液：按樣品前處理方法將空白樣品（未有目標農藥檢出的樣品）制成聯苯肼酯基質溶液，用基質溶液稀釋標準儲備液制備成所需的定量標準溶液，臨用現配。

1.2.2樣品前處理

供試木瓜采自海南島（經測定不含目標化合物）。取全果樣品采用四分法縮分，用食品料理機攪碎，混勻，留250 g樣品。分別準確稱取樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，分別加入5.0 mL 0.25 %乙酸溶液和10.0 mL乙腈，提取過程依據NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》［25］標準方法進行。分取5 mL上層清液于15 mL離心管中，分別加入5 mL 0.25 %抗壞血酸于離心管中，充分混勻，于50 ℃水浴中衍生60 min，冷卻，充分混勻，于40 ℃旋轉蒸發器濃縮，用乙腈定容至5 mL，上機待測。

1.2.3色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.30 mL/min；流動相乙腈-水，洗脫梯度見表1；進樣量2 μL。

表1　梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution parameterss

1.2.4質譜條件

電噴霧正離子掃描，多反應監測模式進行檢測。碰撞氣（氮氣）壓力：6mtorr；氣簾氣壓力：137.9 kPa；霧化氣壓力：344.75 kPa；噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：600.0 ℃。選擇性離子監測見表2。

表2　多反應監測模式下的保留時間、定性、定量離子、去簇電壓及碰撞能量TTaabbllee 22 　　RReetteennttiioonn ttiimmee， qquuaalliittaattiivvee aanndd qquuaannttiittaattiivvee iioonnss， ddeecclluusstteerriinngg ppootteennttiiaall， aanndd ccoolllliissiioonn eenneerrggyy iinn mmuullttiippllee rreeaaccttiioonn mmoonniittoorriinngg （MMRRMM） mmooddee

2　　結果與分析

2.1樣品前處理條件的優化

提取劑的選擇：比較了2 種提取劑乙腈和乙腈中加入乙酸混合提取劑的回收率，結果表明：乙腈提取劑的提取率偏低，致使回收率低于70%，而使用乙腈中加入乙酸混合提取劑的回收率能達到農藥殘留檢測的要求，并最終確定采用乙腈中加入0.25%的乙酸提取。

2.2質譜條件的優化

采用0.05 mg/L的聯苯肼酯標準溶液，以10 μL/min的流速進行Q1掃描，確定母離子，在電噴霧正負離子模式下分別進行全掃描。結果發現：在電噴霧正離子模式下，響應較好，故選擇在電噴霧正離子掃描模式下進行檢測，可滿足靈敏度要求。用蠕動泵儀10 μL/min的流速連續注射，對聯苯肼酯進行一極質譜分析（Q1掃描），得到準確分子離子峰；對準確分子離子峰進行二極質譜分析（子離子掃描）得到碎片離子信息，優化碰撞能量（圖1）。

圖 1　多反應監測模式下聯苯肼酯標準品（a）、木瓜空白樣品（bb）、聯苯肼酯加標樣品（2.0 ng/kg）（c）、聯苯肼酯烯加標樣品（dd）總離子及定量離子流（ee）圖Fig.1　Total and quantitative ion current chromatograms of b ifenazate standard （a）， blank papaya sample （b）， sample spiked with bifenazate （c），and sample spiked with bifenazate-diazene （d）， under multiple reaction monitoring mode （e）

2.3方法的線性方程、精密度和回收率

2.3.1線性方程

將一定質量濃度的基質標準工作溶液按1.2.3節所述條件測定，以聯苯肼酯的定量離子峰面積（y）為縱坐標，以其質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程及相關系數（表3）。結果表明：在0.25～2.0 ng/mL范圍內，方程的線性關系良好。在此條件下，聯苯肼酯的保留時間為2.35 min。

表3　聯苯肼酯的線性方程及其相關系數TTaabbllee 33 　　LLiinneeaarr eeqquuaattiioonn wwiitthh ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffi i cciieenntt ffoorr bbiiffeennaazzaattee

2.3.2檢出限和定量限

根據3 倍信噪比計算，木瓜中聯苯肼酯的檢出限為5.89×10－6mg/kg，通過實際添加回收實驗確定木瓜中聯苯肼酯的定量限為1.0×10－6mg/kg。

2.3.3精密度和回收率

在1.0、2.0 ng/kg和10.0 ng/kg 3 個添加量下進行回收率實驗，平均回收率在78.3%～109.8%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在4.0%～8.8%之間，均滿足定量分析要求，結果見表4。

表 4　聯苯肼酯及聯苯肼酯烯添加平均回收率及相對標準偏差（n==55）Taabbllee 44 　　AAvveerraaggee rreeccoovveerriieess aanndd rreellaattiivvee ssttaannddaarrdd ddeevviiaattiioonnss （RRSSDD） ffoorr bifenazate and bifenazate-diazenee （n = 55）%

3　　結 論

本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜技術，以電噴霧正離子掃描和多反應監測模式，建立了木瓜中聯苯肼酯及聯苯肼酯烯的殘留檢測方法。對其前處理條件進行了考察，并優化了質譜條件，采用基質匹配保準曲線外標法定量，保證了定量的準確性。該方法對供試農藥的定量限為1.0×10－6mg/kg，出峰時間為2.35 min，整個檢測時間為5 min，與傳統液相色譜相比，節省了檢測時間，提高了檢出限。串聯質譜的檢測方法能夠避免雜質的干擾，能很好地排除基質干擾，提高分析的選擇性和檢測靈敏度，該方法的線性、靈敏度、準確度和精密度均能滿足殘留分析的要求。

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Determining of Bifenazate and Its Metabolite Residues in Papaya by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yue， HAN Bingjun， ZHAO Fangfang
（Hainan Provinc ial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Analysis and Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agriculture Science， Haikou571101， China）

An ultra performance liquid chromatography-tan dem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of residues of bifenazate and its metabolite bifenazate-diazene in papaya was established. The sample was extracted with acetonitrile and acetic a cid （0.25%） after being homogenized. The organic phase was then separated fro m water phase b y adding sodium chloride and derivatized for 60 min after the addition of 0.25%. Finally， the target analytes were separated by a Waters ACQUITY UPLC BEH C18column （50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）. A tandem quadrupole mass spectrometer operated in MS/MS mode for multiple-reaction monitoring （MRM） was used for the qualitative and quantitative analyses of the const itue nts. The results showed that the av erage recoveries of bifenazate and bifenazate-diazene ranged from 78.3% to 109.8% with relative standard deviation （ RSDs） of 4.0%-8.8% at spiked levels from 1.0 to 10.0 ng/kg （n = 5）. The calibration curves showed good li nearity in the range of 0.25-2.0 ng/mL， with correlation coeffi cient over 0.999 8. The limit of quantifi cation （LOQ） was 1×10-6mg/kg for both bifenazate and its metabolite. The method is applicable for the determination of bifenazate pesticide residues in papaya.

ultra per formance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； papaya； bifenazate；bifenazate-diazene； residue

O657.72；S482.3

A

1002-6630（2015）24-0270-04

10.7506/spkx1002-6630-201524050

2015-02-04

張月（1981—），女，助理研究員，碩士，主要從事農藥殘留登記研究。E-mail：ghzy_0708@163.com