洋蔥細胞質雄性不育基因分子標記的開發

李永博+劉冰江+霍雨猛+繆軍+楊建平+吳雄+楊妍妍

摘 要：

根據細香蔥orfA501開發的特異引物，以洋蔥細胞質雄性不育系為試材進行PCR擴增，對獲得的片段進行回收測序，根據測序結果設計引物進行染色體步移，獲得部分側翼序列，開發了鑒定洋蔥細胞質基因型的SCAR標記，命名為OC2175。該標記在洋蔥不育系中擴增出一條2 175 bp的特異條帶和1 053 bp的條帶，而保持系中僅擴增出1 053 bp的條帶。對17組不同遺傳背景的不育系及其相應的保持系進行驗證，該SCAR標記的鑒定結果與田間表型判斷結果完全吻合。

關鍵詞：洋蔥;細胞質雄性不育;分子標記

中圖分類號：S633.203.6 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2015）06-0001-04

Development of a Molecular Marker Identifying

Cytoplasmic Male Sterility Gene in Onion（Allium cepa L.）

Li Yongbo1，2，Liu Bingjiang2，Huo Yumeng2，Miao Jun2，Yang Jianping1，Wu Xiong2，Yang Yanyan2*

（1. College of Horticulture Science and Engineering of Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;

2. Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China）

Abstract The specific primers of orfA501 in chives and cytoplasmic male sterile line of onion were used to PCR amplification. The amplified fragment was extracted and sequenced. The primers were designed according to the obtained sequence for genome walking， and partial flanking sequence was obtained. Then a SCAR marker was developed and named as OC2175. With this marker， a special fragment of 2 175 bp could be obtained from the male sterile lines and a 1 053 bp fragment was amplified from both （s）-cytoplasm and （N）-cytoplasm. Seventeen pairs of male sterile lines and their corresponding maintainer lines with different genetic backgrounds were used to verify this SCAR marker. The results indicated that the SCAR marker was perfectly suitable for distinguishing the cytoplasm types S or N in onion.

Key words Onion; Cytoplasmic male sterility; Molecular marker

洋蔥（Allium cepa L.），又稱圓蔥、蔥頭，百合科蔥屬，已有5 000多年的栽培歷史。1936年美國的Jones和Emsweller 首次在“Italian Red”品種中發現雄性不育株[1]，1943年Jones和Clarke又發現了雄性不育系[2]。隨后洋蔥成為世界上最早利用雜種優勢的蔬菜作物之一。洋蔥是兩年生植物，其育種年限是白菜、蘿卜等蔬菜的2～4倍，與傳統的測交-回交、自交等方法相比，分子標記技術直接以DNA形式出現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測，不受季節、環境的限制，可大大縮短不育系和保持系的選育年限，減少工作量，加快育種進程。

國內外關于洋蔥細胞質雄性不育的研究報道較少，Havey[3]利用RFLP分子標記手段找出了洋蔥雄性保持系和不育系線粒體基因組之間的差異。Engelke等[4，5]得到了鑒定洋蔥S型、N型和T型細胞質的分子標記。Sato[6]利用CMS特殊線粒體核苷酸序列的PCR擴增來鑒定洋蔥細胞質基因型。李園園等[8]對洋蔥細胞質雄性不育系及其保持系進行RAPD分析，成功獲得了一個RAPD標記。Kim等[7]在S型和T型細胞質中發現了一個嵌合的開放閱讀框orf725，并且開發了一個區分三種洋蔥細胞質類型的分子標記。

由于細胞質中的DNA序列易產生缺失、插入等變異現象，再加上遺傳背景、人工選擇和自然選擇的差異等，上述很多研究，存在可操作性差、重復性低、不穩定等缺點。本研究旨在結合TAIL-PCR[9]和SCAR標記方法開發一種鑒定洋蔥細胞質育性的分子標記，以準確區分洋蔥S型和N型細胞質，避免選擇的盲目性，提高選擇效率，加快洋蔥細胞質雄性不育系及保持系的選育進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為本課題組選育的17組洋蔥細胞質雄性不育系及其相應的保持系，于2011年9月10日播種于山東省農業科學院蔬菜花卉研究所實驗基地，11月初定植，并提取洋蔥基因組總DNA，2013年6月田間檢測花粉育性。endprint

1.2 DNA的提取及基因池的建立

洋蔥基因組總DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生產的快捷型植物基因組提取試劑盒，提取方法參照說明書。瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測DNA的濃度和質量。

應用分離群體分組分析法（Bulked Segregation Analysis）即BSA法，將不育系的10個單株和與之對應的保持系10個單株的DNA樣品分別等量混合，組成洋蔥細胞質雄性不育系及其保持系的基因池。

1.3 引物的設計與合成

根據Engelke等[5]報道的特異引物5′-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3′和5′-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3′對洋蔥細胞質雄性不育系S118及其相應的保持系N218的DNA進行PCR擴增，對所得片段按照北京天根生化科技有限公司生產的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說明進行回收純化，純化片段克隆至Promega公司的pGEM-T Easy 載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，根據測序結果，應用Premier 5.0設計TAIL-PCR引物進行染色體步移，獲得了該片段的側翼序列。根據獲得的側翼序列設計了一對PCR引物，OC2175-F：5′-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3′;OC2175-R：5′-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3′。由北京博尚生物技術有限公司合成，PAGE純化。

1.4 PCR擴增及檢測

PCR擴增均在美國伯樂的TC-XP-D型基因擴增儀上進行，回收純化片段的擴增參照Engelke和Tatlioglu的方法。所得標記OC2175采用如下體系： 10×PCR Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTPs （each 2.5 mmol/L）2.0 μL，Primer1、2（0.5 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA polymerase 1 U，ddH2O補至25 μL。反應程序為：94℃預變性4 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像系統自動成像。

1.5 單株驗證

將所得標記在17組洋蔥雄性不育系及相應的保持系組合中進行單株驗證。從每個株系中隨機選取10株提取基因組總DNA，進行PCR擴增與檢測，檢測結果與田間觀察判斷結果進行對比。

1.6 DNA序列分析

將獲得的側翼序列在NCBI數據庫中進行BLAST分析。

2 結果與分析

2.1 基因組總DNA的檢測分析

提取所得洋蔥基因組總DNA溶液清亮，無褐化現象。0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示所提取的DNA在點樣孔處無明顯殘留，表明多糖和蛋白質含量均較低; DNA帶位于同一位置，清晰、無彌散、無降解現象（圖1）。在紫外可見分光光度計上測定DNA樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，表明提取的洋蔥基因組總DNA純度較高，適用于PCR擴增、AFLP分子標記等生物學試驗。

M：DNA Marker DL2000;S1～S10：不育系;N1～N10：保持系

圖1 洋蔥基因組總DNA的電泳圖譜

2.2 洋蔥細胞質雄性不育SCAR標記的獲得及序列分析

根據Engelke等[5]報道的特異引物5′-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3′和5′-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3′對洋蔥細胞質雄性不育系S118及其相應的保持系N218的DNA進行PCR擴增，結果僅在S118部分個體中擴增出長度為473 bp的片段，根據473 bp的核苷酸序列，應用TAIL-PCR方法進行染色體步移，獲得了全長為2 175 bp的側翼序列，在此基礎上開發出鑒定洋蔥細胞質基因型的SCAR標記，其擴增引物為OC2175-F和OC2175-R。 應用該標記對洋蔥細胞質雄性不育系S118及其相應的保持系N218進行PCR擴增，結果在洋蔥不育系中均擴增出一條2 175 bp的特異性條帶和一條1 053 bp的條帶，而相應的保持系N218只擴增出1 053 bp的條帶（圖2），將此標記命名為OC2175。

利用NCBI數據庫對2 175 bp的序列進行BLAST搜索比對分析，發現該片段的5′端與洋蔥的COXⅠ基因（GU138027.2）高度同源，同源性達到99%。

M：DNA Marker DL2000;S：S118的單株;N：N218的單株

圖2 引物OC2175-F、OC2175-R對洋蔥不育系及其保持系的PCR擴增結果

2.3 SCAR標記在洋蔥不育系及保持系中的驗證

為了驗證SCAR標記OC2175在分子標記輔助選擇應用上的可行性，利用具有不同遺傳背景的已知細胞質基因型的17個組合材料進行PCR驗證（表1），結果表明，所有的不育系中均擴增出一條2 175 bp的特異性條帶和一條1 053 bp的條帶，而相應的保持系只擴增出1 053 bp的條帶，PCR擴增結果與田間判斷結果吻合。此結果表明應用該引物完全可以鑒別本課題組洋蔥的細胞質基因型。

3 結論與討論

洋蔥是最早發現和利用細胞質雄性不育的蔬菜作物之一[2]。利用Engelke等[5]報道的特殊引物擴增時，有的株系中條帶非常弱或無擴增，認為靶基因可能是以Sublimon的形式存在，因此無法應用到實際育種工作中。劉杰等[10]運用RAPD技術對洋蔥細胞質雄性不育系和保持系的線粒體DNA進行了多態性研究，最終獲得了兩個多態性片段。但由于線粒體DNA的提取過程較復雜，費時費力，使得該標記在大規模田間材料的鑒定工endprint

表1 洋蔥不育系和保持系單株驗證結果

材料編號類型細胞質類型鑒定株數2175 bp1053 bp吻合率（%）

S110早熟黃皮不育10++100

N210早熟黃皮可育10-+100

S118早熟黃皮不育10++100

N218早熟黃皮可育10-+100

S502早熟黃皮不育10++100

N602早熟黃皮可育10-+100

S503中熟黃皮不育10++100

N603中熟黃皮可育10-+100

S505中熟黃皮不育10++100

N605中熟黃皮可育10-+100

S512中熟黃皮不育10++100

N612中熟黃皮可育10-+100

S515中熟黃皮不育10++100

N615中熟黃皮可育10-+100

S520中熟黃皮不育10++100

N620中熟黃皮可育10-+100

S117-5-1中熟紅皮不育10++100

N217-5-1中熟紅皮可育10-+100

S117-5-2中熟紅皮不育10++100

N217-5-2中熟紅皮可育10-+100

S117-11-1中熟紅皮不育10++100

N217-11-1中熟紅皮可育10-+100

S117-10-1中熟紅皮不育10++100

N217-10-1中熟紅皮可育10-+100

S117-10-2中熟紅皮不育10++100

N217-10-2中熟紅皮可育10-+100

S117-10-3中熟紅皮不育10++100

N217-10-3中熟紅皮可育10-+100

SL701長日黃皮不育10++100

NL801長日黃皮可育10-+100

SL702長日黃皮不育10++100

NL802長日黃皮可育10-+100

SL703長日黃皮不育10++100

NL803長日黃皮可育10-+100

注：材料編號中“S”表示不育系，“N”表示相應保持系;“+”表示有擴增片段; “-” 表示無擴增片段。

作中受到限制，且RAPD標記重復性和穩定性較差，其判斷結果可信度不高。

本研究以遺傳背景幾乎完全相同的洋蔥不育系與保持系為試材，利用TAIL-PCR進行染色體步移，獲得側翼序列，在此基礎上設計引物OC2175-F/OC2175-R，開發了鑒定洋蔥細胞質基因型的SCAR標記OC2175。對17個不同遺傳背景的不育系和保持系組合進行驗證，PCR檢測結果和田間判斷結果完全吻合，擴增條帶清晰，無模糊條帶。該結果表明，OC2175是洋蔥不育細胞質的特異性標記，可應用于洋蔥分子標記輔助育種。此外，該SCAR標記只需在苗期提取基因組總DNA，通過簡單的PCR擴增即可鑒定洋蔥細胞質基因型，不僅避免了常規育種方法的繁瑣過程和盲目性，更有效避免了錯誤分類，減少了工作量和育種成本，加快了育種進程，為建立具有普遍意義的洋蔥分子標記輔助育種技術體系奠定了基礎。

參 考 文 獻：

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