性別控制技術的研究進展及在工作犬繁育中的應用

張匯東 高一龍 溫 海

性別控制是指通過對動物的正常生殖過程進行人為干預、能使成年雌性動物產出人們期望性別后代的生物技術，對家畜育種、生產性能提高和遺傳疾病的預防有非常重要的作用。當前國內外性別控制技術主要有兩種途徑：X/Y精子的分離和胚胎的性別鑒定。其中流式細胞儀分離X/Y精子法，是在受精之前就可以控制人們所需性別后代的一種技術，是當前控制性別最有效的方法，其性別控制準確率可以達到90%左右，已在畜牧業生產中產生了明顯的經濟效益。本文簡述了哺乳動物性別控制的原理以及技術方法，并結合犬X/Y精子分離實驗的科學研究進展，展望了該技術在工作犬繁育中的應用前景。

一、性別控制的方法

（一）X/Y精子分離法控制性別

目前主要根據X、Y 精子的物理學、免疫學和生物學差異進行分離，主要有：以X、Y精子DNA含量差異為基礎的流式細胞儀分離法； 以精子所帶電荷性質為基礎電泳分離法；以精子比重大小差異為基礎的沉降分離法；以Y精子特有抗原為基礎的免疫分離法等。

1.流式細胞儀精子分離技術

（1）流式細胞儀精子分離法的發展

流式細胞檢索儀問世于20世紀60年代， 起初主要應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學的研究。Gledhill等首先利用流式細胞儀測定精子的DNA含量，1989年Johnson等報道用流式細胞儀成功地分離得到兔子活的X和Y精子并通過手術方法人工授精產下后代。此后，其它動物(牛、羊、豬等)的活精子相繼分離成功，并用分離的精子通過各種途徑，如AI（人工授精)、IVF（體外受精)、ICSI（細胞質內精子注射)等產下了預知性別的后代。

（2）流式細胞儀分離精子的原理

哺乳動物中通常情況下X染色體較Y染色體大,所以X精子的DNA含量也會高于Y精子。一般認為,當動物的X精子和Y精子的DNA含量差異大于3.5%時,就能用流式細胞儀進行分離。研究證明，X精子和Y精子DNA含量差異越大的物種越容易分離，犬的X精子和Y精子DNA含量的差異為3.9%,理論上可以通過分離精子進行性別控制。

流式細胞儀分離技術采用熒光素Hochest33342對精子進行染色，由于X精子的DNA含量高于Y精子,所以在激光照射下發出的熒光也比Y精子強，通過X精子和Y精子分離儀光電信號的相互轉變,使活力旺盛的X精子和Y精子得到有效分離,而活力差以及畸形的精子在分離過程中被剔除,并通過人工授精、體外受精等技術,使雌性動物產下預知性別的后代。

（3）流式細胞儀分離精子的應用

英國的Cogent公司于2000年首先開始將性別分離精子投入商業使用，為其下屬牧場主提供奶牛分離精子的服務。目前已有包括美國、中國、加拿大、墨西哥、阿根廷等國家相繼進入精子分離產業化應用行列。我國內蒙、新疆、黑龍江、廣西等省市自治區都紛紛引進該分離儀器進行精子分離試驗。

在國內，王建國等采用流式細胞分離法獲得的性控凍精對奶牛進行人工授精,母犢出生準確率為93.3%, 極顯著高于普通凍精的母犢率，高慶華和魏海軍于2006年9月和2007年9月成功分離梅花鹿和馬鹿精液，速度已能達到每秒分離X、Y精子各4500個，純度均超過91%，并且進行了直腸把握子宮頸法(對馬鹿)和內窺鏡法(對梅花鹿)的低劑量凍精輸精試驗,后代的性別比與輸精的X、Y精子純度均高度吻合。隨著流式細胞檢索儀的改進和相關技術的進步，養牛業中性控精液已商業化使用，綿羊、馬和鹿等也開始進入了實用階段。

2.沉降分離法

X/Y精子流式分離原理示意圖

沉降法的原理是X精子的比重大于Y精子，因此沉積速率也大于Y精子。在重力的作用下，經過一段時間的沉降，X和Y精子可部分分離。但是X 和Y精子的比重差異較小, 此方法不能完全分離精子，因而效率和準確率都不高，生產實踐中很少使用。經過改進的密度梯度離心分離法原理和沉降法相同，用離心力取代沉降，但效果仍不足以進行商業應用。

3.電泳分離法

X和Y精子表面所帶電荷量不同,在電場中的運動速率也有所差別，所以可通過電泳將X與Y精子分離。但近年來的實驗發現, 電泳法準確率不高, 重復性較差，而且會對精子造成比較大的損傷，所以此方法在生產實踐中也比較少用。

4.免疫學分離法

免疫法利用免疫反應識別X和Y精子。H-Y抗原只有在Y精子表達,所以可利用H-Y抗原和特異性抗體結合將兩類精子分離。但此方法對精子處理的時間過長,影響精子活力,應用受限。

（二）胚胎鑒定的性別控制方法

1.細胞學方法

細胞學方法通過鑒別胚胎細胞核型來確定胚胎性別。該方法準確率非常高，甚至可達到100%，但由于過程繁瑣，對操作人員以及實驗儀器的要求較高等一系列原因，限制了該技術在生產實踐中的應用。

2.免疫學方法

免疫學方法是通過H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測胚胎上雄性特異性H-Y抗原, 存在H-Y抗原為雄性, 否則為雌性。常用的檢測胚胎H-Y抗原的方法是間接免疫熒光法。該方法在準確率和效率方面有所欠缺，應用不廣泛。

3.分子生物學方法

分子生物學方法是隨著分子生物學理論和實驗技術快速發展而出現的一種通過檢測Y染色體上SRY基因來鑒別動物胚胎性別的方法,存在SRY基因為雄性, 否則為雌性, 應用最多的有DNA 探針法和PCR 擴增法。由于分子生物學方法有準確、快速的優點，已廣泛應用于動物胚胎性別鑒定中。

二、性別控制技術在工作犬繁育中的作用和應用前景

（一）性別控制在工作犬繁育中的作用

1. 滿足警方在各個專業方向對不同性別警犬的使用需求

在警犬的使用過程中，由于性別差異，公犬和母犬在兇猛性、嗅覺靈敏性、訓練使用的耐力和持久性等警用性能方面各有特點。基層一線的使用實踐證明，雖然母犬在氣味作業過程中嗅認仔細程度好于公犬，但公犬體格比母犬高大，兇猛性普遍高于母犬，且公犬在追蹤耐力和作業持久性等方面優于母犬，所以在巡邏、治安防范等領域的基層帶犬民警傾向于挑選公犬進行訓練、執行任務；母犬性成熟后，平均每年發情兩次，發情期間其警用性能普遍下降；在大型安保活動中，一只母犬發情就會影響到一群執行安保任務的其他警犬（公），不能正常工作。因此，一般而言公犬比母犬更受帶犬民警的歡迎。通過性別控制無疑可以增加公犬繁殖比例，以滿足一線帶犬民警的用犬需求。

2.減少伴性遺傳病高危犬系家族后代的患病幾率

目前發現有很多種犬類伴性遺傳病，如與X染色體關聯的犬類遺傳疾病：血友病、重度聯合免疫缺陷癥、肌肉萎縮癥、漸行性視網膜萎縮等。對于這些與X染色體關聯的伴性遺傳病高危犬群家族，可以采用性別控制技術，繁殖雌性胎兒，以降低伴性遺傳病高危犬系家族后代的患病的幾率。通過合理實施性別控制，可以減少警犬伴性遺傳病發病幾率，實現優繁優育，提高犬群的遺傳素質和警用性能。

3. 增加遺傳和表型性別的選擇強度

控制警犬后代的性別比例，可增加選種強度，最大限地發揮良種公犬的遺傳繁殖潛力，加快優質種公犬遺傳基因的傳播速度，加快遺傳進展。這項技術的廣泛應用必將對優質種公犬擴群、優化犬群結構、犬群整體警用性能的提高等方面產生重大影響。

（二）工作犬性別控制技術的研究進展和應用前景

雖然國內外現在對牛、羊、鹿等哺乳動物，利用流式細胞儀分離精子進行性別控制技術的研究開展得如火如荼，比如奶牛的性控精液已經實現了商業化生產和應用，取得了較好的經濟效益。但在犬的性別控制技術方面，國內外鮮見報道，還沒有成功系統的研究。主要由于犬特殊的生理生殖特性，國內外對于犬的人工授精、體外受精、細胞質內精子注射等技術還不是很成熟，導致流式細胞儀分離XY精子的性別控制技術的應用受到了很大限制，但國內外的研究人員還是對工作犬的流式分選XY精子開展了少量實驗研究。

M·A·Meyers等（2007）對拉布拉多犬的鮮精進行了流式細胞儀分選X/Y精子的實驗研究，結果表明分離后的X/Y精子的平均純度約為82%, 分離后的Y精子直接進行人工授精，實驗母犬生產了5頭仔犬（3公，2母），性控準確率為60%；Barbara Merlo等（2015）采集了14頭雜種/純種雄性犬的精液，對其稀釋染色后分離X/Y精子，并研究了分離后冷凍稀釋液的配方以及低溫存儲的流程，結果表明X/Y精子的分離效果較好，純度可以達到85%左右，但解凍后的活力只有2.4 ±1.2%，因此還需進一步研究流式分離后的冷凍稀釋保護液的配方以及低溫存儲的流程。

國內也有相關機構開展了此類的研究，但截至目前并無成功系統研究的公開報道。公安部南京警犬研究所通過開展犬人工授精和胚胎移植等項目的研究工作，熟練掌握了人工授精和胚胎移植等關鍵技術，在犬的現代繁殖生物技術方法方面積累了豐富的經驗。 《性別控制技術在警犬培育中的應用》項目研究團隊，經過近三年的實驗研究，目前取得了系列進展：已經成功分離出工作犬的X/Y精子，其平均純度在85%以上，分離后的X/Y冷凍性控精液也成功受孕，Y精液受孕母犬產仔3窩（16公，4母），X精液受孕母犬產仔1窩（5母，1公）。但在研究過程中，我們也發現工作犬的X/Y精子流式分選對受試種公犬的精子質量要求很高，品種和個體差異性都較大，技術參數不穩定。且相對牛、鹿等哺乳動物，精子分選的速率不高，流式分選的經濟成本也較高，想要實現由實驗室到實際繁育生產中的大規模的推廣應用任重道遠。

相信隨著相關技術的進步和儀器設備的改進,流式細胞儀等分離精子的方法會越來越完善, 經濟成本也會越來越低，犬精子流式分選性別控制技術在工作犬繁育生產中的應用前景也越來越廣泛，必將產生巨大的經濟效益和社會效益。