美洲鰣魚精子超低溫冷凍保存技術初探

王明華　陳友明　丁淑燕　鐘立強　秦欽　邊文冀　蔡永祥　陳校輝

摘要：對美洲鰣魚精液的超低溫冷凍保存技術進行了研究。以解凍后精子的活力為參數，探討了魚用任氏液為稀釋液、不同體積分數甲醇為保護劑、不同凍前平衡時間以及不同精液稀釋比對美洲鰣魚精液進行超低溫冷凍保存的保護效果。結果顯示，以魚用任氏液和體積分數為10%的甲醇組成抗凍保護劑，精液稀釋比（精液與抗凍保護劑的體積比）為1 ∶3 ，于4 ℃冰箱平衡20 min，液氮面上方6 cm處平衡10 min，然后在液氮面上平衡5 min，最后投入液氮中的保存方式，保存60 d后檢查精子活力，存活率可達80%。研究結果為保護淡水魚類的種質資源提供了理論基礎。

關鍵詞：美洲鰣魚；精液；抗凍保護劑；超低溫保存

中圖分類號： S965.219.12 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0250-02

美洲鰣魚（Alosa sapidissima）屬鯡形目鯡科，魚肉細脂厚，味道鮮美，營養豐富，為集約化養殖的優良品種。美洲鰣魚與我國的長江鰣、富春江鰣同科不同地理種群，且其自然分布水域緯度相同，肉味和外形也基本一致。據調查，由于野生資源的破壞，已有十多年未能在長江捕到長江鰣魚，資源瀕臨滅絕，恢復長江鰣魚資源已經很難。自2003年美洲鰣魚被引進中國作為長江鰣魚的替代品[1] ，美洲鰣魚養殖在中國呈現出廣闊的市場前景[2]。精子超低溫保存技術能為珍稀物種和重要經濟種類基因資源的長期保存提供有效的技術手段，在繁殖生物學、遺傳育種和種質資源保護等方面具有重要意義。超低溫保存是一種有效的并能長期保存鮮精的方法[3]。迄今為止約有200多種海淡水魚類被用于超低溫保存研究[4-5]，而關于美洲鰣魚精液的超低溫保存研究卻未見報道，本研究開展美洲鰣魚精子超低溫冷凍保存技術研究，為更好地保護利用優良美洲鰣魚種質資源提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

美洲鰣魚精子樣品來源于南通龍洋水產有限公司海安中洋河鲀莊園養殖的美洲鰣魚親本，它們生長良好、形態正常、無疾病、達到性成熟。

1.2 試驗方法

1.2.1 精子采集 2014年5月15日，采用促黃體釋放激素類似物（LHRH-A2）、促絨毛膜性腺激素（HCG）、馬來酸地歐酮 （DOM）、魚類催產助劑對挑選的成熟雄魚進行注射催情；同年5月16日采取擠壓法采集精子。所采集的精液要求乳白色，無血污、糞便污染。采集的精液于4 ℃冰箱中暫存備用。

1.2.2 鮮精質量的檢測 先用細口吸管吸1滴激活液于載玻片上，對準視野，然后用解剖針針尖在裝有精液的培養皿中挑取適量精液，取出后立即在載玻片上的激活液中攪勻觀察，激活液激活后測活力。觀察3～5個視野，精子活力（存活率）統計方法為估測視野中活動精子的數量占全部精子數量的百分比，取其平均值，選取活力達90%以上的精子作為后續試驗材料進行冷凍保存。

1.2.3 稀釋液和抗凍劑 稀釋液為魚用任氏液，配制方法為：0.780 g NaCl，0.021 g CaCl2，0.020 g KCl，0.200 g NaHCO3 加雙蒸水至1 L，pH值8.0。 抗凍劑為甲醇，分別配制了5%、10%、15%3個不同體積分數，置4 ℃冰箱預冷備用。

1.2.4 精子冷凍保存方法 精子于4 ℃冰箱分別平衡0、10、20、30 min；在液氮面上方6 cm處平衡10 min，然后在液氮面上平衡5 min，最后投入液氮中。

1.2.5 不同稀釋比的樣品制備 經清水激活鏡檢后，選擇精子活力好的精液與抗凍保護劑按1 ∶3、1 ∶5、1 ∶8、1 ∶10的體積比稀釋，混勻樣品后，以每管1 mL樣品量存放于凍存管內。

1.2.6 冷凍精子活力檢測 精子在液氮中保存60 d后，將其從液氮中取出，于液氮口處平衡5 min后，再于37 ℃水浴中快速解凍直至融化，立即放入顯微鏡視野下，用清水激活后觀察運動力。

2 結果與分析

2.1 不同體積分數甲醇抗凍劑對保存效果的影響

在美洲鰣魚精液中加入3個不同體積分數的甲醇抗凍劑，在超低溫（-196 ℃）冷凍保存60 d，解凍后顯微鏡觀察表明，10%甲醇作為抗凍劑，保存效果最好，精子存活率達到80%；甲醇體積分數為5%時，精子存活率最低，保存效果最差（表1）。

2.2 凍前平衡時間對保存效果的影響

以魚用任氏液和10%甲醇組成抗凍保護劑，測定0、10、20、30 min平衡時間對美洲鰣魚精子存活率的影響。結果顯示，在平衡時間20 min時精子存活率最高（表2）。

2.3 不同精液稀釋比對保存效果的影響

用魚用任氏液作稀釋液、10%甲醇作抗凍保護劑，對用不同精液稀釋比保存的精子活力進行測定，表3結果顯示精液按1 ∶3稀釋時，凍精存活率最高，達到80%。

3 討論與結論

目前精液超低溫冷凍保存的方法一般遵循的原則是慢凍速融，本試驗的結果符合該原則。關于魚類精液保存稀釋液的配制，由于試驗用魚種類的不同，稀釋液也有所差異。稀釋液的配制是魚類精液冷凍保存中關鍵的一步，稀釋液的適合與否直接影響到保存結果[6]。一般認為稀釋液的成分在合適的范圍內越簡單越好，目前用于魚類精液超低溫冷凍保存的稀釋液配方多數都是借鑒家畜的精液超低溫保存配方或者憑經驗配制。魚用任氏液是被廣泛用于淡水魚類精子的稀釋液[7]，本研究選用了任氏液配方作稀釋液進行冷凍保存，取得了較好的試驗效果。不同的稀釋倍數對精子的保存效果不同，在3個不同的稀釋比試驗中，以1 ∶3的稀釋比保存效果最好。在加抗凍保護劑之前，于4 ℃平衡20 min，既可以降低溫度速降帶來的損傷，又能使抗凍劑充分滲透。于海濤等認為，平衡一段時間有利于抗凍劑更好地發揮作用，并且精子在冷凍之前代謝活動降低，對低溫冷凍有一個逐步適應的過程[8]。

由于不同種類魚的精子生理特性具有很大差異，確定最適的抗凍劑種類和濃度非常重要[9]。甲醇是較為常見的滲透性抗凍劑，應用于少數水生生物精子冷凍也取得了較好的抗凍效果。由于抗凍劑的毒性會隨著其濃度升高而增強，因此所用抗凍劑濃度一般不會超過15%，本試驗中抗凍劑甲醇的濃度最高為15%。Pan等研究發現，10%甲醇對黃顙魚冷凍保護效果最佳[10-11]。本研究選用3個不同體積分數的甲醇抗凍劑，結果表明10%甲醇抗凍劑對美洲鰣魚冷凍有較好的保護效果。

有關魚類精液的冷凍方法，目前文獻報道的主要有3種，即顆粒凍精法、安瓿瓶法、麥細管法。選用哪種方法受試驗條件和技術手段的限制，最終結果也各有優劣。曾經有不少學者用顆粒凍精法冷凍精子并獲得較高的受精率，但是由于該方法需要特殊的解凍液，實用性不高。安瓿瓶體積較大，降溫難以均勻，且操作比較復雜。本試驗采取的塑料凍存管冷凍法具有操作簡便、安全的特點，易于廣泛推廣應用。

通過精液冷凍保存技術，可將一些名貴、優良的淡水魚類精液，尤其是將那些瀕危、珍稀物種的種質資源進行長期有效的保存。通過建立相應的魚類種質資源庫，將這些物種的基因資源完全保存下來，可為淡水魚類種質資源的保護開辟一條新的途徑。

參考文獻：

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[9]王曉愛，楊君興，陳小勇，等. 軟鰭新光唇魚精子的超低溫冷凍保存[J]. 動物學研究，2012，33（3）：283-289.

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