VEGF基因多態性與2型糖尿病視網膜病變的相關性*

福建醫科大學附屬第一醫院　陳鯉敏　徐國焱　謝茂松　徐國興

VEGF基因多態性與2型糖尿病視網膜病變的相關性*

福建醫科大學附屬第一醫院陳鯉敏徐國焱謝茂松徐國興

目的：探討血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）基因啟動子rs699947（-2578C/A）多態性與糖尿病視網膜病變（DR）的相關性。方法：提取161例并發DR的2型糖尿病患者（病例組）和213例未并發DR的2型糖尿病患者（對照組）的 DNA，PCR反應擴增含rs699947（-2578C/A）位點的 DNA片段，限制性內切酶Bgl II酶切，測定rs699947（-2578C/A）基因多態性。結果：糖尿病視網膜病變組VEGF rs699947（-2578C/A）基因 AA型基因頻率高于對照組，CC基因型明顯低于對照組。糖尿病視網膜病變危險因素的多元逐步Logistic回歸分析顯示，血糖、高血壓、高血脂是糖尿病的獨立危險因素，攜帶VEGFrs699947 AA基因型的2型糖尿病患者發生DR的危險性明顯增高。結論：VEGF基因啟動子-2578C/A多態性與DR病有關，攜帶AA基因型的2型糖尿病患者發生DR的危險性較高。

糖尿病視網膜病變血管內皮細胞生長因子基因多態性

糖尿病視網膜病變（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病最常見和最嚴重的微血管并發癥之一，發病率高，后果嚴重，加強對易感人群篩查和預防的研究具有十分重要的意義，對其病因和預防的研究是熱點。家族聚集性、同卵雙生子較高的一致性及某些種族中的高發率均強烈提示DR有遺傳易感性［1-2］，說明除了糖尿病病程、血糖水平、高血壓等高危因素之外，遺傳因素在DR的發生發展中也起了重要作用。因此，DR是由不同致病機制造成且與遺傳和環境相關的多因子疾病。

VEGF是DR發生發展中刺激新生血管生長和導致血管高滲透性的首要因素。臨床研究顯示，在PDR患者的玻璃體和房水中VEGF表達明顯增高。近年來，VEGF的單核苷酸多態性位點與DR的相關性關系研究倍受關注。為探討VEGF基因啟動區-2578C/A單核苷酸多態性與DR發病的關系，我們于2009年10月～2014年10月進行了如下研究。

1　資料

1.1臨床資料

選擇2009年10月～2014年10月收治的2型糖尿病患者374例為研究對象，其中男198例，女176例，年齡40～70歲，病程0～20年，均為漢族，相互間無血緣關系。根據1999年世界衛生組織制定的糖尿病診斷標準確診。根據是否發生DR分為實驗組和對照組，其中實驗組161例，對照組213例。除外酮癥酸中毒、心力衰竭、高血壓危象、妊娠。

1.2糖尿病視網膜病變診斷標準

根據眼底照相及眼底血管熒光造影結果提示微血管瘤形成、滲出、出血等改變，并按照2002年悉尼國際眼科會議制定的DR分型新標準進行診斷分期。根據檢查結果，凡符合上述條件之一者即入選為實驗組。

2　方法

2.1標本采集

所有被檢者均禁食12～14h，晨起空腹抽取靜脈血5 mL，在抗凝管中混勻，置于-80℃保存，其中2mL用作DNA提取，另3mL靜脈血分離血清行三酰甘油（triglyeeride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和血糖測定，并且測量血壓。

2.2DNA的提取與擴增

兩組均于入院次日清晨采集空腹靜脈血5mL，加EDTA抗凝，-80℃保存。用百泰克公司中量全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA。

2.3VEGF C-2578-A多態性基因型測定

采用PCR法行DNA擴增。VEGF基因上游引物序列5′-GCACCTCCACCAAACCACAGCAACAT-3′，下游引物序列為5′-CAAGCCCCCTTTTCCTCCAACTCTCC-3′（由TaKaRa公司合成）。PCR反應體系中各組分的終濃度為DNA樣本0.5μg，10×PC Buffer2.5μL，Taq DNA聚合酶2.5U，dNTPs 0.2μmol/L，上下游引物各0.4μmol/L，滅菌純凈水補足體積至25μL。擴增條件：95℃預變5min，95℃1min，66℃1min，72℃1min，循環35次，72℃延伸7min。于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒定電壓90V，紫外透射反射儀下觀察結果。

2.4VEGF基因C-2578-A多態性檢測

取10μLPCR產物，加限制性內切酶Bgl II（10U）1μL，10×Buffer2μL，雙蒸水（ddH2O）7μL，組成20μL的反應體系。 置于37℃恒溫水浴箱中反應6h。酶切反應結束后，取10μL酶切產物與2μL上樣緩沖液混合均勻，置于瓊脂糖凝膠，在恒定電壓90V、紫外透射反射儀下觀察結果。計算VEGF基因-2578C/A等位基因頻率、等位基因頻率 VEGF基因-2578C/A多態性與DR關系。

2.5統計學分析

采用Hardy-Weinberg平衡分析法檢驗各組基因型頻率的群體代表性。采用SPSS11.0版軟件包對實驗組和對照組的基因型和等位基因頻率分布進行χ2檢驗，DR危險因素分析使用多元逐步Logistic回歸。

3　結果

3.1研究對象的一般資料比較

各組年齡差異的比較采用t檢驗，結果顯示，年齡構成差異無統計學意義（P＞0.05）。各組性別差異的比較采用χ2檢驗，結果顯示，性別構成差異無統計學義（P＞0.05）。

3.2VEGF基因PCR擴增產物的酶切結果

VEGF rs699947 PCR擴增片段，經Bgl II限制性內切酶消化可產生3種基因型。

圖1　VEGF基因限制性內切酶切產物電泳結果（部分）

3.3DR危險因素的多元逐步Logistic回歸分析

將所有研究對象作為整體進行分析。以VEGF基因rs699947位點的等位基因、血脂（TG、TC）、血壓（收縮壓、舒張壓）和血糖各影響因素為自變量，以有無DR為因變量進行多因素多元逐步Logistic回歸分析。結果發現，血糖、高血壓、高血脂是糖尿病的獨立危險因素，攜帶VEGF rs699947 AA基因型的2型糖尿病患者發生DR的危險性明顯增高。

3.4DR組與對照組

VEGF基因rs699947位點基因型頻率及等位基因分布頻率的比較。DR組與對照組的VEGF基因均存在CC、CA、AA 3種基因型，其分布符合Hardy-Weinberg平衡法，說明達到遺傳平衡，具有群體代表性。如表1所示，VEGF基因rs699947位點基因型頻率及等位基因頻率在研究組和對照組間的差異均具有統計學意義（P＜0.05）。DR組基因型與對照組相比，AA基因型明顯增高，CC基因型明顯降低（P=0.04，P＜0.05），其等位基因A頻率則明顯高于對照組。攜帶rs699947AA基因型的糖尿病患者發生DR的危險性較rs699947CC基因型及CA基因型攜帶者高。

表1　DR組與對照組VEGF基因rs699947位點基因型頻率及等位基因頻率的比較

4　討論

糖尿病視網膜病變是一個多因素、多環節致病的復雜病理生理過程。遺傳背景、環境因素以及兩者的相互作用在其發生、發展的過程中均發揮著重要的作用。本實驗結果提示，高脂血癥、糖尿病和高血壓等都是促使DR發生的重要危險因素。同時通過多元逐步Logistic回歸分析顯示，血糖、高血壓、高血脂是糖尿病的獨立危險因素，這符合DR的一般規律。VEGF基因存在多個單核苷酸多態性位點，糖尿病視網膜病變研究最多的通常位于啟動子區、5’非翻譯區和3’非翻譯區。VEGF基因多態性位點rs699947位于VEGF基因的啟動子區域。本研究發現，其中攜帶rs699947 AA基因型的糖尿病患者發生糖尿病視網膜病變的危險性較高。VEGF基因rs699947位點基因型頻率及等位基因頻率在DR組和對照組間的差異均具有統計學意義。

VEGF是DR發生發展中刺激新生血管生長和導致血管高滲透性的首要因素。臨床研究顯示，在PDR患者的玻璃體和房水中VEGF表達明顯增高。近年來，VEGF的單核苷酸多態性位點同DR的相關性關系研究倍受關注，迄今為止，這方面的研究在歐洲白種人群、亞洲日本人群和印度人群已有報道，但尚未有統一明確的結論。高加索人VEGF基因多態性與DR的嚴重程度有明確關系［3-5］，有研究認為VEGF基因多態性可作為印度人群DR的主要遺傳風險因素［6］。 Koji Nakanishi等發現，在日本人群的1型糖尿病患者中VEGF內含子2的單核苷酸多態性可作為DR進展的早期指標［7］。而Kangas-Kontio等則認為VEGF基因型多態性與DR無顯著性相關［8］。國內學者通過meta分析對VEGF-2578C/A基因多態性與DR的發生發展的相關性也存在著分歧［9-10］。以上分歧考慮與所取樣本人群種族、研究人群的入選標準不同有關。關于VEGF-2578C/A基因多態性與DR的關聯性以及影響DR發生發展的機制，還有待進一步擴大樣本量并進一步深入研究。

［1］Arar NH，Freedman BI，Adler SG，et al.Heritability of proliferative diabetic retinopathy：the FIND Eye study［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008（49）：3839-3845.

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［3］Amanda J.Churchill，1 James G.Carter，et al.VEGF polymorphisms are associatedwithseverityofdiabeticretinopathy［J］.Investigative Ophthalmology&Visual Science，2008，4（8）：3611-3616.

［4］Sotoodeh Abhary，Kathryn P.Burdon，Aanchal Gupta，et al.Common sequence variation in the VEGFA gene predicts risk of diabetic retinopathy［J］. Investigative Ophthalmology&Visual Science，2009，50（12）：5552-8.

［5］Al-Kateb H，Mirea L，Xie XL，et al.Multiplevariants in vascular endothelial growth factor（VEGF）gene are risk factors for severe retinopathy in type I diabetes：the DCCT/EDIC genetics study［J］.Diabetes，2007（56）：2161-2168.

［6］Balasubbu S，Rajendran A，Ramasamy K，et al.Association of VEGF and Enos gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy［J］.Molecular Vision，2006（12）：336-41.

［7］Koji Nakanishi，Chizuru Watanabe.Single nucleotide polymorphisms of vascular endothelial growth factor gene intron 2 are markers for early progression of diabetic retinopathy in Japanese with type 1 diabetes［J］. Clinica Chimica Acta，2009，402（1-2）：171-175.

［8］Kangas-Kontio T，Vavuli S，et al.Polymorphism of the manganese superoxide dismutase gene but not of vascular endothelial growth factor gene is a risk factor for diabetic retinopathy［J］.Br J Ophthalmol，2009，93（10）：1401-1406.

［9］Lu Y，Ge Y，Shi Y，et al.Two polymorphisms（rs699947，rs2010963）in the VEGFA gene and diabetic retinopathy：an updated meta-analysis［J］.BMC Ophthalmol，2013（13）：56.

［10］Han L，Zhang L，Xing W，et al.，The associations between VEGF gene polymorphisms and diabetic retinopathy susceptibility：a meta-analysis of 11 case-control studies［J］.J Diabetes Res，2014：805801.

福建省自然科學基金（項目編號：2012J01344），通訊作者：徐國興。