漫反射光譜測量皮窗模型中血管的血氧飽和度*

李藝容，林黎升，劉麗娜，陳德福，，顧 瑛，李步洪*

（1.醫學光電信息科學與技術教育部重點實驗室，福建省光子技術重點實驗室，福建福州350007；2.中國人民解放軍總醫院激光醫學科，北京100853）

漫反射光譜測量皮窗模型中血管的血氧飽和度*

李藝容1，林黎升1，劉麗娜1，陳德福1，2，顧 瑛2，李步洪1*

（1.醫學光電信息科學與技術教育部重點實驗室，福建省光子技術重點實驗室，福建福州350007；2.中國人民解放軍總醫院激光醫學科，北京100853）

血管中的血氧飽和度（Oxygen saturation，StO2）作為影響血管靶向光動力療法（Vascular targeted photodynamic therapy，V-PDT）療效的關鍵要素之一，實驗測量了活體裸鼠背皮窗模型中血管的漫反射光譜（450-800 nm），并通過擬合漫反射光譜數據定量獲得了血管中的StO2。同時，研究了高氧、低氧和常氧等三種不同氧條件下V-PDT中血管的StO2和血管管徑的變化情況。結果表明，高氧和常氧條件下的平均StO2和血管收縮較為顯著，但低氧組的平均StO2和血管收縮不明顯。在相同氧條件和不同光照功率密度條件下，V-PDT前后靶向血管的平均StO2與血管管徑的變化之間沒有顯著相關性，但V-PDT前后平均StO2的變化量與光照功率密度之間呈正相關。

血管靶向光動力療法；皮窗模型；漫反射光譜；血氧飽和度；血管收縮率

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.003

血管靶向光動力療法（Vascular targeted photodynamic therapy，V-PDT）是一種聯合利用光、光敏劑和氧分子，通過一系列光物理化學反應消耗氧分子［1］，產生單線態氧（1O2）等活性氧物質并引起血管損傷的靶向療法。V-PDT已廣泛應用于選擇性治療血管性疾病，如前列腺腫瘤、鮮紅斑痣和老年性黃斑變性等［2］。在V-PDT過程中，氧的消耗會造成靶向血管中氧分子的減少，從而可能降低活性氧物質的產量，進而影響V-PDT的療效［3］。與此同時，血液中氧含量變化還將改變組織的光學特性，影響V-PDT的治療深度和治療效果［4］。因此，監測V-PDT中靶向血管內的氧含量對于實時優化和調整的治療方案，提高療效具有重要的意義。

研究表明可以采用核磁共振［5］、頻域光子遷移光譜［6］和傅里葉變換光譜成像［7］、光聲顯微成像［8］、多光譜成像［9］以及反射光譜［10］等技術測量血液中的氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度并計算獲得組織中的StO2，從而間接地獲得組織中的氧含量。與其它技術相比，漫反射光譜技術通過便攜式光譜儀實現數據采集，測量裝置相對簡單，具有無損、快速、可重復和高性價比等優點而在臨床上得到了初步的應用。Wang等人利用漫反射光譜研究了PDT前后C3H小鼠中RIF腫瘤的StO2相對變化量，并發現StO2相對變化量與PDT療效之間呈正相關性［11］。Woodhams等人利用可見光反射光譜實驗研究了組織壞死程度與StO2的關聯性，保持相同治療光劑量，當激光功率密度較低時，被測組織StO2減少緩慢且變化量越小，但組織壞死程度越高［12］。此外，王穎等使用漫反射光譜技術臨床監測V-PDT治療鮮紅斑痣過程中氧含量的變化，通過觀察漫反射光譜特征變化來反應不同顏色病變組織StO2的變化情況［13］。上述研究表明漫反射光譜技術可用于組織StO2的檢測，但尚未見活體鼠背皮窗模型中血管的StO2的漫反射光譜檢測以及StO2與血管形態變化關系的研究報道。

本文首先驗證了漫反射光譜技術檢測鼠背皮窗內血管StO2的可行性，分別獲得了鼠背皮窗模型中血管在V-PDT前后StO2的變化關系。其次，研究了不同氧條件對V-PDT血管管徑變化的影響，并分析在相同治療光劑量條件下，StO2的變化量與激光光照功率密度和血管管徑變化之間的關系。

1　材料與方法

1.1化學藥物

采用光敏劑玫瑰紅（Rose bengal，RB）（Sigma-Aldrich.，St.Louis，USA）開展V-PDT實驗。將RB溶于生理鹽水制備成濃度為12.5 g/mL的儲存液，放置于4℃避光環境中備用。實驗時將儲存液稀釋至所需給藥劑量濃度，光敏劑溶液制備在暗室條件下完成。

1.2裸鼠脊背皮窗模型

實驗采用年齡大約10-12周，體重為25-30 g的雄性BALB/c裸鼠（Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.Ltd.，Shanghai，China）建立裸鼠脊背皮窗模型［14］。按每公斤體制80～90 mg/kg的劑量將戊巴比妥鈉溶液（北京化學試劑公司）經腹腔注射使裸鼠處于麻醉的狀態后，通過手術在裸鼠背部縫合安裝鈦合金皮窗（SM100，APJ Trading Co.，Ventura，USA），在鼠背皮窗一側去除一層直徑為10 mm區域的皮層，之后將圓形玻璃蓋玻片放置于皮層去除區域，該模型可全視窗直接觀察表皮和皮下血管。

1.3V-PDT實驗

裸鼠經戊巴比妥鈉溶液麻醉后，通過尾緣靜脈注射RB溶液（給藥劑量25 mg/kg）后立即進行VPDT照光。所用的治療光源為532 nm半導體激光器（Changchun new industries optoelectronics technology Co.，Ltd.，China），經光纖（R400-7-UV-VIS，ocean optics Inc.，USA）耦合后均勻地輻射靶向區域。VPDT過程中將裸鼠放置于加熱墊上以確保其體溫維持正常（33-34℃）［16］。為了消除測試過程中外界環境和動物的抖動帶來的影響，所有的測試均在黑暗的環境中且在固定的操作臺上進行。

18只鼠背皮窗模型隨機分成三組開展不同氧條件的V-PDT實驗，分為高氧組、低氧組和常氧組（n= 6）。高氧組裸鼠在V-PDT過程中吸入Carbogen氣體（95%O2和5%CO2），低氧組裸鼠吸入氮氧混合氣體（92%N2和8%O2），常氧組則正常呼吸空氣。實驗采用光功率密度100 mW/cm2進行照光，照光時間為300 s，每次V-PDT治療的光劑量均為30 J/cm2。在常氧組中還開展了不同光照功率密度的V-PDT對照實驗。在上述100 mW/cm2（n=6）光照實驗組的基礎上，增設了50 mW/cm2（n=6）和200 mW/cm2（n=7）光照實驗組，對應的照光時間分別為600和150 s。同時還增加了1個無光敏劑無光照的空白對照組（n=2）和3個無光敏劑有光照的光照對照組（50 mW/cm2（n=2），100 mW/cm2（n=2）和200 mW/cm2（n=2））。

1.4白光圖像采集

實驗采用徠卡體式顯微鏡（Leica MZ 16FA，Wetztar，Germany）分別在V-PDT前后對靶向區域的血管進行8×觀察并采集鼠背皮窗的白光圖像。

1.5漫反射光譜測量

利用自行研發漫反射光譜系統在V-PDT治療前后分別對靶向區域進行漫反射光譜數據采集［17］。漫反射光譜系統由鹵素燈（HL-2000-HP，Ocean Optics Inc.，USA），傳輸和收集光的Y型光纖（200 μm core diameter，NA=0.22，Ocean Optics Inc.）以及微型光纖光譜儀（QE65000，Ocean Optics Inc.，USA）組成。

首先采集暗背景光譜和鹵素燈光源的參考光譜，參考光譜測量利用漫反射標準白板（WS-1，Ocean Optics Inc.）反射率＞95%，獲得鹵素燈光源的參考光譜并存儲。然后將QE65000微型光譜儀測量模式設置為漫反射光譜測量模式。測量時在所有的皮窗模型中，V-PDT前后分別選取3個感興趣區域（ROI）進行漫反射光譜數據采集（波長范圍為450-800 nm），對每一個采集區域進行三次測量。測量過程中光纖探頭與血管保持垂直測量的角度且緊貼于血管。最后，對所測量的漫反射光譜進行擬合，獲得靶向區域血管中的StO2。

1.6血管中的StO2

血管中的StO2取決于血管內氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度，其特征值表示為式（1）: CHbO2和CHb分別表示氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度［18］。

對扣除暗背景和標準白板反射譜后的漫反射光譜根據式（2）進行擬合計算獲得［19］。

其中C是反射信號的振幅，ρ是相對血液體積分數，μαHbO2血液中完全含氧的吸收系數，μαHb（λ）血液中完全缺氧的吸收系數。其中平均StO2變化量指的是單個皮窗模型中各個采集區域V-PDT前與V-PDT后StO2的變化量取平均。

此外，利用Leica Qwin軟件（version 3.2.0，Leica，Cambridge，UK）定量分析鼠背皮窗血管白光圖像獲得血管管徑的變化，其中血管收縮率可定義為［20］:

其中，Dbefore和Dafter分別表示V-PDT前后靶向血管的管徑。

2　結果與討論

2.1白光圖像和漫反射光譜

圖1（a）和（b）分別給出了輻射光功率密度為100 mW/cm2的V-PDT前后鼠背皮窗的白光圖像，其中黑色圓圈ROI-1，ROI-2和ROI-3為StO2的測量位置。V-PDT后靶向區域血管出現局部收縮，血管管徑減小。圖1（c）和（d）中三條曲線分別對應的是VPDT前和V-PDT后血管ROI-1，ROI-2和ROI-3的漫反射光譜和擬合曲線，V-PDT前后血管的漫反射光譜形狀發生了顯著變化，V-PDT前在542和577 nm處存在明顯的吸收峰使得譜線呈現W型，而V-PDT后譜線則變為V型，這與王穎等人之前的測量結果一致［13］，V-PDT后血管中氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的相對濃度發生了變化。對V-PDT前和V-PDT后ROI-1，ROI-2和ROI-3漫反射光譜分別進行擬合獲得相應的StO2。結果發現:V-PDT前ROI-1，ROI-2和ROI-3的StO2分別為84.0%，77.8%和75.6%，測量結果與Wang等人利用光聲成像技術測量的結果基本一致［8］，即靜脈StO2為70%～75%，動脈StO2為90%以上，動靜脈平均StO2為80%～82.5%。實驗表明，利用漫反射光譜技術測量鼠背皮窗中的血管漫反射光譜，通過數學擬合光譜數據間接獲得靶向區域的StO2方法可行，客觀，準確，為以鼠背皮窗為模型的相關血氧檢測實驗研究提供了實驗依據。V-PDT后ROI-1，ROI-2和ROI-3的StO2分別為16.4%、11.7%、31.3%，與V-PDT前相比各個靶向區域的StO2均有顯著下降，這是由于氧的光化學消耗以及光動力效應導致血管的封閉引起的［21］。

2.2血管經V-PDT后的平均StO2和血管管徑的變化

圖1　皮窗中血管在V-PDT（a）前和（b）后的白光圖像以及對應ROIs在V-PDT（c）前和（d）后的漫反射光譜Fig.1　Stereomicroscope images of blood vessels in the entire dorsal window chamber（a）before and（b）after V-PDT，and the corresponding diffuse reflection spectra of ROIs（c）before and（d）after V-PDT

表1　不同氧條件下血管經V-PDT后的平均StO2和血管管徑變化Tab.1　The average StO2and diameter for the blood vessel before and after V-PDT when the nude mice breathing either hypoxic，normoxic，or hyperoxic air under normobaric conditions

從表1可以發現，V-PDT前高氧組血管的平均StO2顯著高于常氧組（P＜0.001），而低氧組的平均StO2則顯著低于常氧組（P＜0.001）。V-PDT前后相比高氧組和常氧組的平均StO2均有顯著降低（P＜0.001），對應的靶向區域的平均血管管徑顯著減少（P＜0.001），而與低氧組V-PDT前后相比，平均StO2和平均血管管徑雖有減少，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2給出了低氧，高氧和常氧三種不同氧條件下對應的平均血管收縮率情況。由圖2可知高氧組和常氧組的平均血管收縮率較高，且兩組平均血管收縮率無顯著差別（P＞0.05），而低氧組的平均血管收縮率較小（P＜0.001）。我們小組之前的研究表面RB溶液在高氧和常氧組氧條件下1O2的發光強度之間無明顯差異，而在低氧條件下，1O2發光強度較小［22］，這與我們的平均血管收縮率的變化相一致，表明V-PDT過程中1O2在低氧條件下產量降低，導致血管收縮不明顯。

圖2　不同氧條件下血管經V-PDT后的平均血管收縮率Fig.2　Theaverage vasoconstrictionsof blood vessels after V-PDT under hypoxic，normoxic and hyperoxic conditions

分析比較實驗組和對照組V-PDT前后血管管徑和StO2變化情況，發現大部分實驗組ROI出現不同程度的收縮現象，相應的血管StO2均出現不同程度的下降。實驗組的19只裸鼠中有13只（50 mW/cm2實驗組5只，100和200 mW/cm2實驗組各4只）裸鼠血管出現顯著收縮，其平均血管收縮率為56%± 15%。有5只裸鼠（50 mW/cm2實驗組1只，100 mW/cm2實驗組1只以及200 mW/cm2實驗組3只）V-PDT后血管出現輕微收縮，其平均血管收縮率為2 %±1%。另有100 mW/cm2實驗組1只裸鼠出現血管輕微擴張，管徑增大，但其對應的StO2在V-PDT后也有所下降。不同激光功率密度下，平均血管收縮率與平均StO2變化量之間沒有顯著的關聯性。此外，空白對照組和光照對照組均無觀察到血管收縮或者擴張現象，且StO2也未改變。這說明僅有光熱效應不會對血管造成實質性的損傷，對氧含量的變化亦不會產生影響，表明V-PDT在一定劑量的光、光敏劑和氧分子共同作用下，血管內皮細胞的損傷和血小板黏附可引起血管局部收縮［23］。

圖3對實驗組鼠背皮窗靶向區域血管的StO2數據進行分析，從圖3我們可以清楚地看到平均StO2變化量與激光功率密度在標準的范圍內呈現出線性關系（R2=0.9297）。圖中的誤差是由于裸鼠個體間差異性導致。隨著輻射光功率密度的增加結果StO2變化越大，兩者是成正相關的關系。在較高功率密度下StO2減少速度快且減少量大。相反，在低光功率密度時，StO2減少緩慢且變化量小。V-PDT對照組的StO2前后沒有顯著變化。由于三個功率密度的照光時間分別為600 s，300 s和150 s，所以較高功率密度下StO2消耗速度快，這與通過吸收光譜技術測量溶液［24］或者腫瘤［18］模型下的實驗結論一致，隨著激光功率密度增大，PDT過程StO2變化得越大且消耗得越快。

圖3　平均StO2相對變化量與光照功率密度之間的關系Fig.3　The V-PDT induced change in StO2was positively correlated with various irradiances

3　結論

光動力反應導致氧含量的消耗是影響V-PDT療效的一個關鍵因素，因此監測StO2的變化以實時調整V-PDT治療方案有助于提高V-PDT的療效。我們驗證了利用漫反射光譜技術檢測皮窗模型中血管StO2具有可行性。在不同氧條件V-PDT下裸鼠皮窗模型中靶向血管的StO2和血管管徑變化情況不同。高氧組和常氧組的平均StO2減少和平均血管收縮均較為顯著，而低氧組的平均StO2減少和平均血管收縮不明顯。此外，在相同氧條件不同功率密度V-PDT下，靶向血管的平均StO2均有顯著減小，但其變化量與平均血管收縮率之間無顯著的關聯性。同時，光功率密度越大，靶向血管的StO2減少得越快且越多，平均StO2減少量與激光功率密度之間呈正相關。

［1］ DOUGHERTY T J，GOMER C J，HENDERSON B W，et al. Photodynamic therapy［J］.Journal of the National Cancer Institute，1998，90（12）:889-905.

［2］SITNIK T M，HAMPTON J A，HENDERSON B W.Reduction of tumour oxygenation during and after photodynamic therapy in vivo: effects of fluence rate［J］.British Journal of Cancer，1998，77（9）:1386.

［3］HENDERSON B W，BUSCH T M，VAUGHAN L A，et al.Photofrin photodynamic therapy can significantly deplete or preserve oxygenation in human basal cell carcinomas during treatment，depending on fluence rate［J］.Cancer Research，2000，60（3）: 525-529.

［4］SOLONENKO M，CHEUNG R，BUSCH T M，et al.In vivo reflectance measurement of optical properties，blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels，kidneys and prostates［J］.Physics in Medicine and Biology，2002，47（6）:857.

［5］REED M W，MULLINS A P，ANDERSON G L，et al.The effect of photodynamic therapy on tumor oxygenation［J］.Surgery，1989，106（1）:94-99.

［6］PHAM T H，HORNUNG R，BERNS M W，et al.Monitoring tumor response during photodynamic therapy using near-infrared photon-migration spectroscopy［J］.Photochemistry and Photobiology，2001，73（6）:669-677.

［7］KOSTENICH G，KIMEL S，PELED S，et al.Monitoring PDT-induced damage using spectrally resolved reflectance imaging of tissue oxygenation［J］.Cancer Letters，2005，219（2）:169-175.

［8］ZHANG H F，MASLOV K，SIVARAMAKRISHNAN M，et al. Imaging of hemoglobin oxygen saturation variations in single vessels in vivo using photoacoustic microscopy［J］.Applied Physics Letters，2007，90（5）:053901-053901-3.

［9］MOY A J，WHITE S M，INDRAWAN E S，et al.Wide-field functional imaging of blood flow and hemoglobin oxygen saturation in the rodent dorsal window chamber［J］.Microvascular Research，2011，82（3）:199-209.

［10］ AMELINK A，KOK D J，STERENBORG HJCM，et al.In vivo measurement of bladder wall oxygen saturation using optical spectroscopy［J］.Journal of Biophotonics，2011，4（10）:715-720.

［11］WANG H W，PUTT M E，EMANUELE M J，et al.Treatment-induced changes in tumor oxygenation predict photodynamic therapy outcome［J］.Cancer Research，2004，64（20）:7553-7561.

［12］WOODHAMS J H，MACROBERT A J，BOWN S G.The role of oxygen monitoring during photodynamic therapy and its potential for treatment dosimetry［J］.Photochemical&Photobiological Sciences，2007，6（12）:1246-1256.

［13］王穎，廖小華，顧瑛，等.漫反射光譜用于光動力治療中鮮紅斑痣皮膚氧含量監測的初步研究［J］.光譜學與光譜分析，2010，30（12）:3363-3366. WANG Yin，LIAO Xiaohua，GU Ying，et al.Preliminary study on oxygen content monitoring for port wine stainsduring PDT using diffuse reflection spectra［J］.Spectroscopy and Spectral A-nalysis，2010，30（12）:3363-3366.

［14］LEHR H A，LEUNIG M，MENGER M D，et al.Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice［J］. The American Journal of Pathology，1993，143（4）:1055.

［15］LIN L，LI Y，ZHANG J，et al.Vessel constriction correlated with local singlet oxygen generation during vascular targeted photodynamic therapy［C］.Proc SIPE，2014:92680T.

［16］ENDRICH B，ZWEIFACH B W，REINHOLD H S，et al.Quantitative studies of microcirculatory function in malignant tissue:influence of temperature on microvascular hemodynamics during the early growth of the BA 1112 rat sarcoma［J］.International Journal of Radiation Oncology·Biology·Physics，1979，5（11）: 2021-2030.

［17］QIU Z，CHEN D，WANG Y，et al.Monitoring blood volume fraction and oxygen saturation in port-wine stains during vascular targeted photodynamic therapy with diffuse reflectance spectroscopy:Results of a preliminary case study［J］.Photonics&Lasers in Medicine，2014，3（3）:273-280.

［18］STRATONNIKOV A A，DOUPLIK A Y，KLIMOV D V，et al. Absorption spectroscopy as a tool to control blood oxygen saturation during photodynamic therapy［C］.Proc SPIE，1997，3191: 58-66.

［19］KIM A，ROY M，DADANI F，et al.A fiberoptic reflectance probe with multiple source-collector separations to increase the dynamic range of derived tissue optical absorption and scattering coefficients［J］.Optics Express，2010，18（6）:5580-5594.

［20］MIDDELBURG T A，DE BRUIJN H S，TETTERO L，et al.Topical hexylaminolevulinate and aminolevulinic acid photodynamic therapy:complete arteriole vasoconstriction occurs frequently and depends on protoporphyrin IX concentration in vessel wall［J］. Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology，2013，126:26-32.

［21］JUZENIENE A.Oxygen effects in photodynamic therapy［M］.in Popp J，Tuchin VV，Chiou A，Heinemann SH（eds）.Handbook of Biophotonics Vol.2:Photonics for Health Care.Weinheim: WILEY-VCH Verlag&Co.KgaA，2011.305-314.

［22］CHEN L，LIN L，LI Y，et al.Effect of oxygen concentration on singlet oxygen luminescence detection［J］.Journal of Luminescence，2014，152:98-102.

［23］KHURANA M，MORIYAMA E H，MARIAMPILLAI A，et al. Intravital high-resolution optical imaging of individual vessel response to photodynamic treatment［J］.Journal of Biomedical Optics，2008，13（4）:040502.

［24］STRATONNIKOV A A，DOUPLIK A Y，LOSCHENOV V B. Oxygen consumption and photobleaching in whole blood incubated with photosensitizer induced by laser irradiation［J］.Laser Physics，2003，13（1）:1-21.

Measurement of Oxygen Saturation for Blood Vessels in Dorsal Window Chamber Using Diffuse Reflection Spectroscopy

LI Yirong1，LIN Lisheng1，LIU Lina1，CHEN Defu1，2，GU Ying2，LI Buhong1*
（1.Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of Ministry of Education，Fujian Provincial Key Laboratory for Photonics Technology，Fujian Normal University，Fuzhou 350007，Fujian，China；2.Department of Laser Medicine，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

Monitoring oxygen saturation changes during vasculartargeted photodynamic therapy（V-PDT）is crucial for achieving an optimal therapeutic outcome.In this study，the diffuse reflection spectra in the range from 450 to 800 nm were measured to quantitatively determine oxygen saturation（StO2）of blood vessels in dorsal skinfold window chamber. Furthermore，the changes of the average StO2and vasoconstriction of blood vessels in the region of interest（ROI）after V-PDT was evaluated when the nude mice breathing either hypoxic，normoxic，or hyperoxic air under normobaric conditions，respectively.The average StO2and vasoconstriction of blood vessels for normoxic and hyperoxic groups after VPDT was dramatically changed while no significant change was found for those of blood vessels in hypoxic group.No consistent pattern for the changes of StO2and vasoconstriction during V-PDT treatment can be observed.However，the V-PDT-induced change in StO2was positively correlated with various irradiances.

vascular targeted photodynamic therapy；dorsal window chamber；diffuse reflection spectroscopy；blood oxygenation saturation；vasoconstriction

Q631

A

1007-7146（2015）04-0320-06

2015-06-18；

2015-07-24

國家自然科學基金項目（61275216）；國家衛計委科學研究基金（WKJ-FJ-30）；福建省自然科學基金項目（2014J07008，2014J01225）

李藝容（1989-），男，碩士研究生，主要從事光動力療法劑量學方面研究

李步洪（1973-），男，教授，博士生導師，主要從事生物醫學光子學研究。（電話）0591-83465373；（電子郵箱）bhli@fjnu.edu.cn