頂空及SERS結合快速檢測蔥屬植物—大蔥揮發物*

司民真，李　倫，張川云，張德清

（1.楚雄師范學院云南省高校分子光譜重點實驗室，云南楚雄675000；2.楚雄師范學院光譜應用技術研究所，云南楚雄675000）

頂空及SERS結合快速檢測蔥屬
植物—大蔥揮發物*

司民真1，2，李倫1，2，張川云1，2，張德清1，2

（1.楚雄師范學院云南省高校分子光譜重點實驗室，云南楚雄675000；
2.楚雄師范學院光譜應用技術研究所，云南楚雄675000）

建立了常溫常壓下快速檢測新鮮蔥屬植物-大蔥主要揮發性氣體的方法。采用頂空瓶在常溫常壓下收集大蔥的揮發物，將揮發物用注射器注入納米銀膠中，進行SERS測量。結果表明大蔥的揮發物SERS光譜重現性非常好；將大蔥揮發性物的SERS譜與1-丙硫醇（1-Propanethiol）和烯丙基甲基硫醚（allyl methyl sulfide）混合氣體的SERS譜相比，具有較好的相似性，說明大蔥的揮發物主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚氣體組成。利用Gaussian 03軟件獲得1-丙硫醇-銀（1-Propanethiol-Ag）的Raman光譜，計算結果與1-丙硫醇的SERS實驗結果對應較好，說明1-丙硫醇在納米銀基底上的增強為化學增強。頂空與SERS結合可直接用于對蔥屬植物揮發性物的研究。

蔥屬植物；大蔥；揮發性氣體；頂空；SERS；納米銀溶膠

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.008

蔥屬（Allium L.）是百合科（Liliaceae）蔥族（Allieae）的重要類群，全世界700多種［1］，中國有138多種［2-3］。蔥屬植物含有豐富的生物活性物質，具有多種生理功能，是世界重要蔬菜、藥用和觀賞植物資源。國內外學者對蔥屬植物化學成分及藥理作用已進行了大量研究，并分離提取出多種類型化合物；如:Reena lawrence等人對大蒜精油抗氧化性進行研究，表明大蒜精油是有效地清除自由基，是一種強大的抗氧化劑［4］。Camila Rodrigues Ad?o等人從Allium ampeloprasum var.porrum中分離出一種甾體皂苷，發現其具有較好的抗炎性［5］。另外，揮發油的化學成分和含量差異也可作為蔥屬植物分類的參考依據，Storsberg等人認為揮發性含硫化合物在蔥屬中具有種的特異性和較穩定的遺傳特性，有著重要的分類學意義［6］。楊天慧等采用靜態頂空（SHS）固相微萃取法及氣相色譜一質譜（GC-MS）聯用儀對5種類型大蔥、洋蔥遠緣雜交后代及其親本中的揮發性成分進行分析，證明雜交后代及其親本中的揮發性成分有一定相似性和差別性［7］。

目前對蔥屬植物揮發性物質的研究大多采用頂空微萃取-氣象色譜/質譜聯用法或氣相色譜/質譜聯用法如:Block，E等高效氣相色譜與質譜聯用測試了蔥、蒜、韭等8種蔥屬植物的揮發油成分［8］。劉源等采用項空固相微萃取氣質聯用分析檢測了香蔥的揮發性風味成分，共檢測到30種化合物［9］。汪瀟等采用頂空固相微萃取和氣質聯用的方法測定其揮發性成分，分別分離得到了多種風味物質［10］。這些方法雖然準確性較高，但耗時、費用高、對樣品有一定的破壞性。

Raman光譜具有指紋特性，能夠給出樣品的化學組成方面的信息，而且操作簡單快捷、制備樣品用量少、無損、靈敏度高、廉價等優點，Raman光譜技術已經被廣泛應用于各個領域。而SERS技術能夠增強拉曼信號，具有極高的靈敏度，對某些分子的靈敏度比常規拉曼光譜高102-1014倍，能檢測吸附在金屬表面的單分子層和亞單分子層的分子，并提供豐富的分子結構信息。但使用SERS技術直接應用于植物揮發性氣體檢測中的報道并不多見，韓國首爾大學的Kwan kim等將2，6-二甲基苯異腈吸附納米金上，通過2，6-二甲基苯異腈的N-C伸縮振動峰的峰位發生的移動來間接的檢測植物揮發性有機物標樣［11］。

本課題組結合頂空及SERS技術對蔥屬植物的揮發性氣體進行了研究，并取得了初步成果。本次工作用頂空技術收集植物揮發性氣體，結合SERS分子識別特性，對蔥屬植物-大蔥揮發性氣體進行研究。頂空技術的使用，可以免除煩瑣的樣品前處理過程，可專一性收集樣品中的易揮發性成分，避免有機溶劑帶入的雜質對分析造成干擾；膠態納米銀作為SERS基底，具有較好的穩定性，并有對混合物中特定物質分子選擇增強特性，膠態納米銀中的銀粒子與植物揮發性氣體中的一種或幾種含硫化合物相吸附結合產生拉曼增強效果，從而達到對大蔥揮發性氣體特定物質分子的檢測效果。所得光譜信息希望能為生物化學、分子生物學、及蔥屬植物系統分類提供參考。

1　儀器與試劑

實驗樣品大蔥采購于楚雄市菜市場。硝酸銀，檸檬酸三鈉均為分析純。1-丙硫醇、烯丙基甲基硫醚購于阿拉丁。DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀（DXR Raman Microscope，美國Thermo Fisher），激發波長785 nm，測定功率2 mW，曝光時間30 s，樣品曝光次數3次。UV-vis分光光度計（T-1901，北京普析通用儀器有限公司），分辨率設為2 nm，狹縫寬度設為0.5 nm，掃描范圍200 nm-800 nm。

2　實驗方法

納米銀溶膠的配制采用本課題組的微波加熱法，用去離子水（電阻率為18.25 MΩ·cm）配制0.001 mol/L硝酸銀溶液1 000 mL用用去離子水配制1%的檸檬酸三鈉溶液26 mL在室溫下充分混合后，用微波爐加熱27 min后自然冷卻，制得納米銀溶膠［12］。將銀膠放入瓶中密封保存。

將新鮮大蔥洗凈，將蔥根、莖、葉分開，分別切成均勻的碎塊，各分裝于5個頂空瓶中。每瓶裝五分之四體積左右，共15瓶。裝入靜置20 min后，從頂空瓶頂部抽出揮發氣體緩慢注入1 mL銀膠中充分混合后，置于拉曼光譜儀上進行測試，得到15個SERS光譜圖。分別抽取500 μL烯丙基甲基硫醚、1-丙硫醇液體于頂空瓶靜置15 min后，各抽出揮發氣體注入到1 mL銀膠中充分混合后，置于拉曼光譜儀上進行測試，得到烯丙基甲基硫醚、1-丙硫醇氣體純樣的SERS光譜圖。取500 μL液態烯丙基甲基硫醚裝入頂空瓶中，再按一定比例加入的液態1-丙硫醇，頂空瓶靜置20 min，抽出揮發氣體緩慢注入到1 mL銀膠充分混合后，置于拉曼光譜儀上進行測試，得到烯丙基甲基硫醚和1-丙硫醇混合氣體SERS譜。用DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀所帶的OMNIC 9.0軟件對大蔥須根部揮發性氣體的5個光譜求平均、莖部揮發性氣體的5個光譜求平均、葉部揮發性氣體的5個光譜求平均，分別得到大蔥的須根、莖、葉揮發性氣體平均SERS譜，并對這三個平均SRSE光譜及烯丙基甲基硫醚SERS光譜、1-丙硫醇氣體SERS光譜，烯丙基甲基硫醚和1-丙硫醇混合氣體SERS譜進行歸一化。

圖1　不同時間購買的新鮮大蔥莖部揮發性氣體在不同批次銀膠上的SERS譜，（a）2013年6月樣品+2011年銀膠；（b）2013年7月樣品+2013年7月銀膠；（c）2013年12月樣品+2013年11月銀膠Fig.1　The SERS spectra of volatile organic compounds of fresh green Chinese onion stems which purchase in different time on nano-silver colloid which made in deferent time，（a）June 2013 sample+2011 nano-silver colloid，（b）July 2013 sample+July 2013 nano-silver colloid，（c）December 2013 sample+November 2013 nano-silver colloid

3　結果與討論

3.1樣品揮發性氣體SERS的重現性與銀膠穩定性檢測

為了檢測納米銀膠測試植物揮發性氣體的重現性與穩定性，用不同批次銀膠分別測定不同時間購買的新鮮蔥的莖部揮發性氣體的SERS譜。具體為分別用2011年制備的銀膠測試2013年6月買的新鮮大蔥揮發性氣體SERS、2013年7月制備的銀膠測試2013年7月買的新鮮大蔥揮發性氣體SERS、2013年11月制備的銀膠測試2013年12月買的新鮮大蔥揮發性氣體SERS。發現大蔥的發性氣體的SERS譜峰非常相似。如圖1所示，三次測試的大蔥莖的揮發性氣體SERS譜峰位和峰形對應較好。結果表明:銀膠與新鮮樣品揮發性氣體結合較穩定，以微波法制備的納米銀溶膠為基底測試大蔥揮發性氣體SERS譜的重現性非常好。

3.2大蔥揮發性氣體SERS譜分析

為了考察大蔥的揮發物的主要成分，測試了烯丙基甲基硫醚氣體和1-丙硫醇氣體的SERS譜，圖2中a、b譜線分別為烯丙基甲基硫醚氣體和1-丙硫醇氣體的SERS譜，c、d、e譜線分別為大蔥的根、莖、葉揮發性氣體的SERS譜的平均光譜。從圖2中看出，烯丙基甲基硫醚氣體的SERS譜的特征峰為626、674cm-1，這兩個特征峰在大蔥根、莖揮發性氣體的SERS譜（c、d）可找到對應的譜線622、671 cm-1而在葉中變得不明顯；1-丙硫醇氣體的SERS譜（b）的特征峰為373、702、893、1 024、1 215、1 320cm-1，從圖中大蔥的揮發性氣體SERS譜c、d、e很容易找到對應的譜線373、695、893、1 026、1 216、1 322 cm-1。表明大蔥的揮發性物主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚氣體組成。大蔥揮發性氣體中有較高含量的1-丙硫醇已得到證實，如楊天慧等［7］利用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術對大蔥揮發性成分進行分析，測得1-丙硫醇的相對含量達69%。

圖2c、d、e中大蔥揮發物SERS譜中還有780、1 602 cm-1的譜線在圖2 a、b中未找到相應的譜線，為找到這兩條譜線的來源，我們做了如下的工作:1將1-丙硫醇與烯丙基甲基硫醚按一定比例混合后，測量其揮發氣體SERS譜；2將1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚氣體SERS譜直接相加。圖3 a為1-丙硫醇與烯丙基甲基硫醚按一定比例混合后所得揮發氣體SERS譜，3 b為1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚氣體SERS譜相加結果圖。對比圖3a、b，圖3 a SERS譜比b中多778cm-1和1 605 cm-1兩個峰，對比圖3a與圖2c，大蔥揮發性氣體SERS恰恰有對應的780、1 602 cm-1附近兩個峰，并且圖2 c譜線與圖3 a譜線峰位峰形對應非常好，只是626、674、695 cm-1附近三個峰向低波數分別移動到622、674、695 cm-1附近，這進一步說明大蔥的揮發性氣體SERS光譜主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚氣體的SERS譜帶組成，也說明1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚同時與納米銀溶膠作為基底產生SERS增強時并不是單純的疊加結果，可能還存在某些相互作用。

圖2　（a）烯丙基甲基硫醚揮發性氣體SERS譜；（b）1-丙硫醇揮發性氣體SERS譜；（c）蔥根部揮發性氣體SERS譜；（d）蔥莖部揮發性氣體SERS譜；（e）蔥葉部揮發性氣體SERS譜Fig.2　（a）The SERS spectra of volatile organic compounds of allyl methyl sulfide；（b）1-Propanethiol；（c）greenChineseonionroots；（d）stemsand（e）leaves

圖3　（a）1-丙硫醇與烯丙基甲基硫醚按一定比例混合的揮發氣體SERS譜；（b）1-丙硫醇氣體SERS譜和烯丙基甲基硫醚氣體SERS譜相加的加譜Fig.3　（a）The SERS spectrum of volatile organic compounds of the mixture of liquid 1-Propanethiol and allyl methyl sulfide；（b）The spectrum consists of SERS spectrum of 1-Propanethiol adding SERS spectrum of allyl methyl sulfide

3.31-丙硫醇與納米銀粒子發生吸附行為的模擬計算

在實驗中還發現以下幾個現象:

（1）當1-丙硫醇氣體注入納米銀溶膠以后，納米銀溶膠由灰色變為黑色。

（2）納米銀溶膠的UV-vis吸收光譜吸收峰在440 nm附近，而將1-丙硫醇氣體注入銀膠后，得到的UV-vis吸收光譜吸收峰變寬，最高吸收峰移到了400 nm附近，并且在400-800 nm范圍形成較寬的吸收帶（見圖4）。

圖4　（a）納米銀溶膠的UV-vis吸收光譜，（b）注入1-丙硫醇氣體的納米銀膠聚合物的UV-vis吸收光譜Fig.4　（a）The UV-vis absorption spectrum of the nano-silver colloid；（b）the UV-vis absorption spectrum of silver colloid which was injected into the volatile organic compounds of 1-Propanethiol

以上現象表明1-丙硫醇化學吸附于納米銀上。為了研究1-丙硫醇H原子解離后C3H7S基團中的S與Ag原子發生吸附的行為，理論計算采用Gaussian'03程序，運用HF方法，在LanL2dz基組水平上，對C3H7S-Ag構象的幾何結構進行優化，在優化的基礎上對振動頻率進行了理論計算，所有波數都乘以校正因子為0.93。其結構優化結果如圖5所示，計算得到的Raman光譜如圖6a所示。圖6b是1-丙硫醇氣體SERS譜，比較圖6a、圖6b可以看出，理論計算C3H7S-Ag的Raman譜線和實驗測得1-丙硫醇氣體SERS譜峰位吻合較好。圖6c是1-丙硫醇液體的Raman譜，從圖中可見位于2 573、651 cm-1附近有兩個強的尖峰（分別歸屬為S-H和C-SH伸縮振動），在810 cm-1附近有弱峰（歸屬為S-H變形振動）［13］。而這個三峰在1-丙硫醇氣體SERS譜和大蔥根、莖、葉揮發性氣體SERS譜中都沒有發現。這說明1-丙硫醇在銀膠中的巰基S-H鍵斷裂，解離后的硫醇基團化學吸附在納米銀顆粒上，這與理論計算的結果一致。而且理論研究表明，丙硫醇在Au表面吸附時H原子解離后C3H7S基團中的S與Au原子會產生較多成鍵電荷，形成強化學吸附［14］。表1給出計算的C3H7S-Ag振動頻率、強度以及指認。1-丙硫醇氣體吸附在納米銀上SERS譜的頻率及可能的指認一同列于表1中。

圖5　C3H7S-Ag的優化結構圖Fig.5　Optimized structure of C3H7S-Ag

表1　C3H7S-Ag的理論計算光譜和觀測的1-丙硫醇吸附在銀膠上的光譜的振動歸屬Tab.1　Calculated（scaling factor 0.93）of C3H7S-Ag and observed frequencies of 1-Propanethioladsorbed on nano-silver colloid

圖6　（a）理論計算的C3H7S-AgRaman譜；（b）1-丙硫醇的SERS譜；（c）液態1-丙硫醇的Raman譜Fig.6　（a）Calculated Raman of C3H7S-Ag；（b）SERS spectrum of1-Propanethiol；（c）Raman spectrum of 1-Propanethiol

4　結論

利用納米銀溶膠作為SERS基底對大蔥揮發性氣體進行測試，發現銀膠與新鮮樣品揮發性氣體結合較穩定，大蔥揮發性氣體SERS的重現性非常好；大蔥揮發性氣體主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚氣體組成。理論計算與實驗結果表明都表明1-丙硫醇氣體與納米銀膠基底發生化學吸附。利用納米銀溶膠作為SERS基底可以對大蔥揮發性氣體中的1-丙硫醇、烯丙基甲基硫醚成分進行檢測，具有操作快捷、制備樣品簡單且用量少、無損、靈敏度高、廉價等優點。本研究只是用納米銀溶膠對蔥屬植物-大蔥揮發性氣體進行了測試。對于其他形式的SERS基底、其他種的蔥屬植物揮發性氣體的研究正在進行中。希望利用頂空與SERS結合可以檢測出更多藥用植物揮發性氣體成分。

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Rapid Detection of Volatile Organic Compounds of Green Chinese Onion Using Headspace Combined with SERS

SI Minzhen1，2，LI Lun1，2，ZHANG Chuanyun1，2，ZHANG Deqing1，2
（1.Key Laboratory of Molecular Spectroscopy，Colleges and Universities in Yunnan Province，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunnan，China；2.Application Institute of Spectroscopy Technology，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunan，China）

To develop a rapid method under normal pressure and temperature using Headspace combined with SERS for the detection of the volatile organic compounds of green Chinese onion.Collection volatile organic compounds of green Chinese onion under normal pressure and temperature with Headspace vial，then the gas was drawn from the vial with a syringe and were injected very slowly into nano-silver colloids for test.The SERS spectrum of volatile organic compounds of green chinese onion and the SERS spectrum of the mixture of liquid 1-Propanethiolate and allyl methyl sulfide had been obtained.The results showed that the repeatability of SERS spectrum of volatile organic compounds of green chinese onion was very good.And the SERS spectrum of volatile organic compounds of green Chinese onion mainly consists of 1-Propanethiol and allyl methyl sulfide.The Raman spectra of 1-Propanethiol-Ag had been calculated by Gaussian 03.The calculation corresponded well with SERS of 1-Propanethiol.This suggest that adsorption of 1-Propanethiol on nanosilver colloids is chemisorption.The headspace combined with SERS can be directly used to research volatile organic compounds of Allium.

Allium；green chinese onion；volatile organic compounds；headspace；SERS；nano-silver colloid

R917

A

1007-7146（2015）04-0348-06

2015-05-02；

2015-05-17

國家自然科學基金（11364001，10864001，11064001）資助課題

司民真（1962-），女，漢族，云南昆明人，教授，博士，主要從事分子光譜方面的研究。（電話）0878-3121785；（電子郵箱）siminzhen@cxtc.edu.cn