曲普瑞林對人乳腺癌細胞Fas/FasL基因表達的影響*

龍　昱，粟　敏，李　妍，羅玥佶，朱傳炳

（長沙醫學院基礎醫學系生物化學與分子生物學教研室，湖南長沙410219）

曲普瑞林對人乳腺癌細胞Fas/FasL基因表達的影響*

龍昱，粟敏，李妍，羅玥佶，朱傳炳*

（長沙醫學院基礎醫學系生物化學與分子生物學教研室，湖南長沙410219）

為了觀察GnRH激動劑曲普瑞林對人乳腺癌細胞生長的影響，探討藥物處理后細胞中Fas和FasL基因的表達情況及其與細胞生長的關系，本研究采用了形態學顯微鏡觀察、MTT檢測和Real-time PCR技術，對曲普瑞林處理后乳腺癌細胞的生長增殖情況及Fas和FasL基因表達的變化進行了研究。結果顯示，曲普瑞林可抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長并表現出了劑量依賴性，藥物濃度越大對腫瘤細胞的抑制作用越強。隨著藥物濃度的增大、抑制作用增強，腫瘤細胞中Fas基因的表達量逐漸增大，而FasL基因的表達量卻逐漸下降。推測曲普瑞林在作用過程中可能通過促進腫瘤細胞中Fas的表達，誘導了Fas所介導的細胞凋亡途徑的恢復，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。

曲普瑞林；乳腺癌；Fas；FasL

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.010

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率已位居女性惡性腫瘤的首位。近年來，一些人工合成的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）類似物（如曲普瑞林、阿拉瑞林等）作為腫瘤內分泌治療的藥物已用于女性生殖系腫瘤、前列腺癌等病癥的臨床治療，可起到抑制腫瘤細胞分裂增殖的作用［1-2］。GnRH是由下丘腦神經元分泌的一種十肽激素，是調節機體內分泌系統和生殖系統的重要信號分子［3-4］。目前已在許多激素依賴性腫瘤細胞中發現有GnRH的結合位點，GnRH或其類似物能作為腫瘤細胞自分泌調節因子調控腫瘤的生長和分化［5-7］。乳腺癌作為一種激素依賴性腫瘤，其癌細胞上也發現有GnRH及其受體的表達［8］，GnRH激動劑可抑制癌細胞的生長，推測可能是通過誘導細胞凋亡來實現，但具體作用機制目前尚不明確。Fas又稱為APO-1，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體和神經生長因子（NGF）受體家族，是細胞凋亡的信號分子，也稱為“死亡受體”。FasL是Fas在人體內的天然配體，當Fas與FasL結合后，可活化并傳導凋亡信號，觸發Fas所在靶細胞數小時內凋亡。研究表明多種惡性腫瘤如乳腺癌、胃癌、肝癌、子宮內膜癌、肺癌等組織內有Fas/FasL的表達，其在腫瘤的發生、發展及轉移過程中有重要作用［9-13］。本研究以人乳腺癌細胞為研究對象，用不同濃度GnRH激動劑曲普瑞林（Triptorelin）處理乳腺癌細胞，觀察藥物對細胞增殖活性的影響；并對藥物處理后Fas/FasL在癌細胞中的表達水平變化進行比較研究，分析Fas/FasL表達差異與癌細胞增殖活性的相關性，探討GnRH激動劑誘導細胞凋亡進而抑制生殖系腫瘤細胞增殖的分子機制，為深入研究腫瘤的內分泌治療機理提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

人乳腺癌細胞MCF-7（ER+）由中國科學院上海細胞庫提供。DMEM培養基和澳洲胎牛血清購自Hyclone公司。反轉錄試劑盒、Taq酶及DNA Marker均夠自上海生工生物工程公司。曲普瑞林為白色粉末，使用前用PBS配置成所需的各種濃度。

實驗中所使用的引物均是根據GenBank中人的Fas、FasL及內參β-actin的mRNA序列，用軟件Primer Premier 5.0設計，由上海生工生物工程公司合成引物。

Fas引物序列為:

上游:5′-ATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAA-3′，

下游:5′-TGCACTTGGTGTTGCTGGTGAGTG-3′；

FasL引物序列為:

上游:5′-CACTACCGCTGCCACCCCTGA-3′，

下游:5′-CATCATCTTCCCCTCCATCATCACC-3′；

β-actin引物序列為:

上游:5′-GGCTGTTTTCCCATCCATCG-3′，

下游:5′-CCCATTCCAACCATTACTCCCTG-3′

1.2方法

1.2.1細胞培養 將1×105的處于對數生長期的人乳腺癌細胞MCF-7接種于24孔培養板內進行培養。24 h后，分別加入不同濃度的曲普瑞林（依次為10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L 6個濃度組），每個濃度均設置3個復孔，另外再設置對照孔和無細胞調零孔。然后置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中，分別培養24 h、48 h和72 h，倒置顯微鏡下進行觀察。

1.2.2MTT法檢測細胞抑制率 實驗終止前4 h，每孔加入50 μL MTT溶液（MTT用PBS配成5 mg/ mL，即0.5%MTT）。繼續培養4 h后，終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上低速振蕩10 min。酶聯免疫檢測儀A570nm測量各孔的吸光度值。將所測定的結果按下式計算生長抑制率IR（%）:生長抑制率IR（%）=（1-實驗組平均A570nm/對照組平均A570nm）×100%。實驗全部數據借助EXCEL中的統計軟件進行處理，t檢測分析顯著性水平。

1.2.3Real-time PCR 分別收集細胞并提取其RNA，使用Promega反轉錄試劑盒進行反轉錄。Realtime PCR反應體系為20 μL，其中各引物濃度為20 nmol/L，每管加10 μL的SYBR Green PCR Master Mix（ABI）、5 μL cDNA模板，再用無菌水定容至20 μL。Real-time PCR反應及檢測在Prism 7 500 Sequence Detection System（ABI）上進行。對每一種樣品的分析都重復三次，包括目標基因（Fas、FasL）和作為內參的管家基因（β-actin），以保證結果的準確性。Real-time PCR的反應條件為:50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，61℃45 s，40個循環。用相對標準曲線法2-ΔΔCt對相對定量的結果進行分析，得到相對表達量圖譜，最后用熔解曲線法來檢測實時定量PCR的產物。

2　實驗結果

2.1不同濃度曲普瑞林對MCF-7細胞生長的影響

用10-4～10-9mol/L濃度范圍內的曲普瑞林分別作用于MCF-7細胞，在培養24 h、48 h和72 h后，藥物對細胞增殖活性的影響結果見表1和圖1。結果表明，在10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L等濃度曲普瑞林的作用下，MCF-7細胞的生長均受到了不同程度的抑制。并且隨著藥物濃度的增加，對細胞的抑制作用不斷增強，其中濃度為10-4mol/L的曲普瑞林對不同培養時間內（24 h、48 h、72 h）MCF-7細胞生長的抑制作用均表現為最強（P＜0.01）。此外，通過觀察同種藥物濃度處理下的細胞在不同培養時間的生長情況發現，48 h時的細胞抑制率較24 h時略有降低，但作用72 h時后，細胞抑制率又明顯增大。說明隨著藥物作用時間的延長，藥物對細胞生長的抑制作用有明顯增強。

表1　曲普瑞林對MCF-7乳腺癌細胞增生活性影響的MTT實驗結果Tab.1　The MTT experimental results of the effect of triptorelin on the growth of breast cancer cells

圖1　不同濃度曲普瑞林處理24 h、48 h、72 h后MCF-7細胞的生長情況Fig.1　The growth of MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin after 24 h，48 h and 72 h

2.2Fas及FasL基因表達的半定量分析

經MTT實驗發現，藥物處理72 h后，各種濃度的曲普瑞林對乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用均表現出最強，因此選擇藥物處理72 h后的細胞進行Fas和FasL表達量的分析。不同濃度曲普瑞林處理72 h后，MCF-7細胞中Fas和FasL表達的Real-time PCR結果分別見圖2和圖3。溶解曲線和PAGE膠檢測結果均顯示擴增產物單一且大小符合預期設計。由圖2可見，Fas基因在無藥物處理的MCF-7細胞中表達量較低，但經過不同濃度曲普瑞林處理72 h后，Fas基因在細胞中的表達量隨著藥物濃度的增加而增大，其中10-4mol/L藥物處理后的細胞中Fas基因的表達量最高，10-9mol/L藥物處理后的細胞中Fas基因的表達量最低。

圖2　不同濃度曲普瑞林處理后MCF-7細胞中Fas基因表達情況Fig.2　The expression of Fas gene in MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin control

而由圖3可見，FasL基因在無藥物處理的MCF-7細胞中表達量較高，在經過不同濃度曲普瑞林處理72 h后，FasL基因在細胞中的表達量隨著藥物濃度的增加而逐漸降低，其中10-9mol/L藥物處理后的細胞中FasL基因的表達量最高，10-4mol/L藥物處理后的細胞中FasL基因的表達量最低。這與上述Fas基因的表達情況相反。

圖3　不同濃度曲普瑞林處理后MCF-7細胞中FasL基因表達情況Fig.3　The expression of FasL gene in MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin control

3　討論

實驗研究和臨床觀察都提示，在一些激素依賴性腫瘤如宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌及乳腺癌等的細胞中均存在GnRH結合位點［5-7］，GnRH可作為調節因子調控腫瘤細胞的生長、分化。而在使用GnRH類似物對卵巢癌、子宮內膜癌及乳腺癌的治療中也發現其對相應的腫瘤細胞的生長有抑制作用［1，14-15］，但具體機制尚不十分清楚，推測其可能與誘導細胞凋亡有關系［16-18］。本實驗中使用的曲普瑞林為人工合成的GnRH激動劑，實驗結果也發現曲普瑞林能抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長，藥物濃度越高，抑制作用越明顯，表現出了劑量依賴性。并且隨著藥物處理時間的延長，72 h后藥物對細胞的抑制作用要明顯高于24 h和48 h，說明藥物對細胞的抑制作用隨著時間的增加而增強。

Fas/FasL系統是細胞凋亡中最主要的途徑之一，Fas是細胞凋亡的信號，當其與配體FasL結合后，活化并傳導凋亡信號，從而誘導細胞的凋亡。研究發現很多腫瘤細胞上都有Fas抗原的表達，這些腫瘤可通過Fas反攻擊模式作為逃避機體免疫識別和殺傷的方式，腫瘤細胞通過低表達或不表達Fas而自身表達FasL來誘導腫瘤組織中浸潤的淋巴細胞發生凋亡，從而得以逃避免疫細胞的殺傷及自身的凋亡作用。比如，在一些腫瘤（如卵巢癌、結腸癌、宮頸癌、黑色素瘤、肝癌等）的發展過程中伴有腫瘤細胞中Fas的表達下調或缺失，使細胞對Fas/FasL介導的凋亡產生抵抗，從而使得腫瘤細胞逃避免疫監控而存活，引起腫瘤增殖［9，19］。此外，在對肺癌、子宮內膜癌的研究中發現Fas與FasL表達水平呈負相關，隨著癌細胞惡性程度的增加，Fas下調明顯，FasL表達水平則增高，其逃避機體免疫監視的能力也逐步增強，轉移能力增強［20］。而在一些腫瘤如宮頸癌的化學治療后，可以觀察到癌細胞增殖活性受抑制并出現凋亡現象的同時，還伴隨有Fas表達的上升和FasL表達的下降［21］。

本實驗中我們利用不同濃度的GnRH激動劑曲普瑞林處理乳腺癌細胞MCF-7后，使用Real-time PCR方法檢測了Fas/FasL基因表達量的變化。結果發現在無藥物處理的腫瘤細胞中，Fas的表達量相對較低，而FasL的表達量相對較高，這與其他乳腺癌發生發展研究中所觀察到的Fas下調和FasL上調的結果相似［22］。而在曲普瑞林的作用下，隨著藥物濃度的增大、抑制作用的增強，MCF-7細胞中Fas的表達量逐漸增加，但FasL的表達量相對于無藥物處理時反而出現了降低。這說明曲普瑞林在作用過程中可能促進了腫瘤細胞中Fas的表達，但抑制了FasL的表達，從而誘導了Fas所介導的細胞凋亡途徑的恢復，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。

因此，我們認為GnRH激動劑曲普瑞林對乳腺癌細胞的生長有一定的抑制作用，并且這種抑制作用與刺激濃度及作用時間有關系。推測曲普瑞林作為臨床上的腫瘤內分泌治療的藥物，其抑制腫瘤細胞增殖的機制可能與其誘導了Fas/FasL介導的細胞凋亡途徑的恢復，從而抑制了癌細胞的生長有一定關系。但Fas/FasL介導的細胞凋亡本身是一個復雜的過程，更具體的作用機制還有待于進一步的研究。

［1］ 李雷，冷金花.促性腺激素釋放激素激動劑在惡性腫瘤治療中的應用［J］.中華婦產科雜志，2013，48（3）:230-232. LI Lei，LENG Jinhua.Application of Gonadotrophin-Releasing hormone analogs in treatment of malignant tumors［J］.Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology，2013，48（3）:230-232.

［2］CHUDECKA G A，RZEPKA G I.Favorable effects of long-term therapy with gonadoliberin analogues in three patients with advanced and recurrent ovarian cancer［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2009，30（5）:535-538.

［3］彭華粉，葉貴丹，張明哲.GnRH類似物在COS中的應用研究［J］.保健醫學研究與實踐，2012，9（4）:63-66. PENG Huafen，YE Guidan，ZHANG Mingzhe.Study on the application of GnRH analogues in COS［J］.Health Medicine Research and Practice，2012，9（4）:63-66.

［4］LONG YU，TAO MIN，LIU SHAOJUN，et al.Differential expression of Gnrh2，Gthβ，and Gthr genes in sterile triploids and fertile tetraploids［J］.Cell Tissue Res，2009，338:151-159.

［5］劉曉霞，宗珊，李真，等.GnRH在宮頸鱗狀細胞癌腫的表達及意義［J］.中國免疫學雜志，2012，28（5）:424-427. LIU Xiaoxia，ZONG Shan，LI Zhen，et al.Expression of gonadotropin releasing hormone（GnRH）in cervical squamous cell carcinoma and its significance［J］.Chinese Journal of Immunology，2012，28（5）:424-427.

［6］劉石萍.促性腺激素釋放激素類似物在婦科惡性腫瘤中的應用［J］.國際婦產科學雜志，2012，39（5）:514-517. LIU Shiping.Application of gonadotrophin-releasing hormone analogs in malignant gynecological neoplasms［J］.J Int Obstet Gynecol，2012，39（5）:514-517.

［7］JUNG H C，C BLAKE GILKS，NELLY AUERSPERG，et al. Immunolocalization of gonadotropin releasing hormone（GnRH）I，GnRH II，and type I GnRH receptor during follicular development in the human ovary［J］.J Clin Endocrinol Metabo，2006，91（11）:4562-4570.

［8］高江曼，于洋，喬杰.促性腺激素釋放激素在女性生殖系統的分布與作用［J］.生殖與避孕，2013，33（5）:338-342. GAO Jiangman，YU Yang，QIAO Jie.Distribution and action of Gonadotropin-releasing Hormone in the female reproductive system［J］.Reproduction&Contraception，2013，33（5）: 338-342.

［9］王強，楊志雄，廖思海.Fas、FasL和Caspase-3在肺癌中的表達及其臨床意義［J］.現代腫瘤醫學，2009，17（2）: 248-251. WANG Qiang，YANG Zhixiong，LIAO Sihai.Expression and clinical significance of Fas，FasL and Caspase-3 in lung cancer［J］.Modern Oncolgy，2009，17（2）:248-251.

［10］ 王辰生，李紅方，梁冰鋒.胃癌及區域淋巴結中Fas和FasL的表達與臨床生物學行為關系研究［J］.河北醫藥，2013，35（11）:1637-1639. WANG Chensheng，LI Hongfang，LIANG Bingfeng.Expression of Fas and FasL in gastric cancer and the research of clinical biology behavior［J］.Hebei Medical Journal，2013，35（11）:1637-1639.

［11］賈建軍，王自能，劉革修，等.腫瘤浸潤性樹突狀細胞在子宮內膜癌中的凋亡及其Fas、FasL表達意義［J］.南方醫科大學學報，2011，31（10）:1693-1696. JIA Jianjun，WANG Zineng，LIU Gexiu，et al.Apoptosis and expression of Fas/FasL in tumor infiltrating dendritic cells in human endometrioid adenocarcinoma［J］.J South Med Univ，2011，31（10）:1693-1696.

［12］郭曉東，楊美，郭超楠，等.肝癌組織中凋亡調控因子Fas、FasL及caspase-3的表達及意義［J］.肝臟，2014，19（4）:250-253. GUO Xiaodong，YANG Mei，GUO Chaonan，et al.The expression and significance of apoptosis regulatory factors Fas，FasL and caspase-3 in hepatocellular carcinoma tissues［J］. Chinese Hepatology，2014，19（4）:250-253.

［13］李艷萍，王琳，賈琴，等.Fas/FasL和Bcl-2在人乳腺癌組織中的表達及其與浸潤淋巴細胞的關系［J］.解剖學研究，2009，31（5）:338-341. LI Yanping，WANG lin，JIA Qin，et al.Expression of Fas，FasL，Bcl-2 and its relation with lymphocytes in human breast cancer［J］.Anat Res，2009，31（5）:338-341.

［14］ALKASI O，MEINHOLD H I，ZAKI R.Long-term disease-free survival after hormonal therapy of a patient with recurrent low grade endometrial stromal sarcoma:a case report［J］.Arch Gynecol Obstet，2009，279（1）:57-60.

［15］李敏，張艷賞，張明明，等.GnRH激動劑曲普瑞林對卵巢癌細胞OVCAR3生長的抑制作用及對GnRHⅠ受體、GnRHⅡ受體表達的影響［J］.Chinese General Practice，2011，14（9C）:3119-3122. LI Min，ZHANG Yanshang，ZHANG Mingming，et al.Impact of GnRH agonist triptorelin on proliferation of OVCAR3 ovarian cancer cells and expression of GnRHⅠand GnRHⅡreceptors［J］.Chinese General Practice，2011，14（9C）:3119-3122.

［16］CASTELLON E，CLEMENTI M HITSCHFELD C Effect of leu-prolide and cetrorelix on cell growth，apoptosis，and GnRH receptor expression in primary cell cultures from human prostate carcinoma［J］.Cancer Invest，2006，24（3）:261-268.

［17］WANG Y，MATSUO H，KURACHI O.Down-regulation of proliferation and up-regulation of apoptosis by gonadotropin-releasing hormone agonist in cultured uterine leiomyoma cells［J］.Eur J Endocrinol，2002，146（3）:447-561.

［18］李敏，吳小華.GnRH激動劑Triptorelin對人卵巢癌細胞系SKOV3、OVCAR3生長抑制作用的研究［J］.中國老年保健醫學，2008，6（4）:34-36. LI Min，WU Xiaohua.Study on the inhibitory effect of GnRH agonist triptorelin to Human ovarian cancer cells［J］.Chinese Journal of Geriatric Care，2008，6（4）:34-36.

［19］鄧德厚，史華，張永軍，等.華蟾素注射液對H22肝癌小鼠腫瘤組織中Fas、FasL基因表達情況的影響［J］.中華中醫藥學刊，2014，32（6）:1345-1347. DENG Dehou，SHI Hua，ZHANG Yongjun，et al.Effect of cinobufacini injection on Fas and FasL expression in tumor tissue of mice bearing hepatoma H22［J］.Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2014，32（6）:1345-1347.

［20］李朝霞，李秀霞.Fas和FasL在肺癌組織中的表達及臨床意義［J］.西安交通大學學報（醫學版），2002，23（5）: 450-453. LI Zhaoxia，LI Xiuxia.The expression and clinical significance of Fas and FasL in lung cancer［J］.Journal of Xi'an Jiaotong University（Med Sci），2002，23（5）:450-453.

［21］董艷，王蓁，王翔宇.Survivin、Fas與FasL在宮頸癌介入化療前后組織中的表達及意義［J］.現代婦產科進展，2012，21（6）:474-477. DONG Yan，WANG Zhen，WANG Xiangyu.Expression of Survivin，Fas and FasL in cervical carcinoma tissue before and after the arteria femoralis interventional chemotherapy and clinical significance［J］.Prog Obstet Gynecol，2012，21（6）: 474-477.

［22］張令宇，馬文鋒，楊棟.Hsp70、Fas和FasL在乳腺癌中的表達及其意義［J］.中國腫瘤臨床與康復，2005，12（3）: 193-196. ZHANG Lingyu，MA Wenfeng，YANG Dong.Expression and significance of Hsp70，Fas and FasL in breast cancer［J］. Chin J Clin Oncol Rehabil，2005，12（3）:193-196.

Effect of Triptorelin on Fas/FasL Gene Expression in Human Breast Cancer

LONG Yu，SU Min，LI Yan，LUO Yueji，ZHU Chuanbing*
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Changsha Medical University，Changsha 410219，Hunan，China）

In order to observe the effect of GnRH aganist triptorelin on the growth of human breast cancer cells，and to explore the expression of Fas and FasL gene in drug treated cells and its relationship with cell growth，the morphological microscope，MTT detection and Real-time PCR were used to study the proliferation and the expression of Fas and FasL gene of breast cancer cells which were treated by the triptorelin.The results showed that triptorelin could inhibit the growth of breast cancer cells MCF-7 and exhibited a characteristic of dose-dependent，the higher the concentration of drugs，the stronger inhibition of tumor cells.It was also observed that the higher the concentration of reagents，the expression of Fas gene in breast cancer cells gradually increased，but the expression of FasL gene was gradually decreased. Therefore，it suggested that the triptorelin might promote the expression of Fas gene in tumor cells，which induced the recovery of the Fas mediated apoptosis pathway，then the growth of tumor cells were inhibited.

triptorelin；breast cancer；Fas；FasL

R737.9

A

1007-7146（2015）04-0358-06

2015-05-02；

2015-06-12

湖南省科技廳科技計劃資助項目（2011FJ3096）；湖南省教育廳科學研究資助項目（No.10C0467）

龍昱（1982-），女，土家族，湖南長沙人，副教授，博士，主要從事內分泌學及腫瘤生物化學研究。（手機）13787129182；（電子郵箱）19429068@qq.com

朱傳炳（1948-），男，湖南長沙人，教授，學士，主要從事心臟發育的基因調控及分子信號轉導研究。（手機）13787006775；（電子郵箱）12298634@qq.com