TTF1-NP誘導人肝癌 HepG-2細胞凋亡的內質網應激作用

肖　斌，劉榮榮，劉炳彤，張學武

(延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 延吉133000)

TTF1-NP誘導人肝癌 HepG-2細胞凋亡的內質網應激作用

肖斌，劉榮榮，劉炳彤，張學武

(延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 延吉133000)

目的：通過不同劑量長白山珍珠梅黃酮納米粒(TTF1-NP)分別誘導不同種人肝癌細胞和人正常肝細胞凋亡，探討TTF1-NP對不同細胞的作用及涉及的內質網應激作用機制。方法：以體外培養的不同種人肝癌細胞(Hep3B、HepG-2和PLC/PRF/5)和人肝細胞(Chang Liver)為模型，實驗分為陰性對照組、陽性對照組(5-Fu)和TTF1-NP實驗組，TTF1-NP處理濃度分別為50、100和200 μmol·L-1。采用MTT法檢測TTF1-NP對不同種細胞的生長抑制作用，選擇最佳抑制效果細胞(HepG-2)為主要研究細胞株；利用流式細胞術檢測細胞凋亡率；應用Western blotting和免疫細胞化學染色技術檢測內質網應激關鍵蛋白表達情況；通過內質網應激抑制劑4-苯丁酸(4-PBA)作用，再次檢測相關蛋白的表達情況。 結果:與陰性對照組比較，不同濃度的TTF1-NP組4種細胞生長抑制率升高(P<0.05或P<0.01)，且呈一定的濃度和時間依賴關系。細胞凋亡檢測，與陰性對照組比較，TTF1-NP實驗組隨藥物濃度增加其細胞凋亡率逐漸上升(P<0.05或P<0.01)；內質網應激關鍵蛋白GRP78和caspase-4 隨著TTF1-NP濃度增加，表達水平逐漸升高(P<0.05或P<0.01)。4-PBA有效抑制GRP78和caspase-4表達，與TTF1-NP組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。 結論： TTF1-NP可誘導人肝癌 HepG-2 細胞凋亡；內質網應激途徑是 TTF1-NP 誘導人肝癌 HepG-2 細胞凋亡的主要作用機制之一。

珍珠梅黃酮納米粒；內質網應激；細胞凋亡；肝腫瘤

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應是真核生物體內一個復雜的、多功能的信號轉導途徑，參與生物體內的細胞凋亡、自噬和氧化應激等多種生物現象[1-2]。研究[3-4]表明：ERS 參與多種腫瘤的發生、發展過程。ERS 通過活化未折疊蛋白反應、介導自噬、誘導細胞凋亡和調節氧化應激等發揮調節腫瘤生長的作用，ERS 與肝癌的發生、發展也密切相關。長白山珍珠梅(Sorbaria Sorbifolia) 屬薔薇科植物，被《抗癌中藥大辭典》收錄為長白山抗癌藥。本課題組前期研究[5-6]發現：珍珠梅發揮抗癌作用的主要成分為5，2′，4′- 三羥基- 6，7，5′- 三甲氧基黃酮(TTF1)，TTF1可以抑制小鼠S180肉瘤及人肝癌HepG-2細胞生長，其主要作用機制與抑制腫瘤血管生成及活化線粒體途徑誘導細胞凋亡有關。珍珠梅黃酮納米粒(TTF1-NP)是以生物體內可降解材料硬脂酸為載體，采用乳化-低溫固化法制備生物體，可降解吸收的直徑為150～200 nm的新劑型。本實驗探討TTF1-NP誘導人肝癌HepG-2 細胞凋亡過程中內質網應激作用機制，為在天然植物中篩選新的抗肝癌藥物提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人肝癌細胞(HepG-2、Hep3B和PLC/PRF/5)和人正常肝細胞(Chang Liver)為本教研室凍存。TTF1由延邊大學藥學院關麗萍老師惠贈，小牛血清和DMEM培養基為美國Gibco公司產品，Annexin V-FITC凋亡試劑盒為美國BD公司產品，caspase-4、GRP78和β-actin抗體為英國Abcom公司產品，蛋白檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。DYY-7C電泳儀為北京市六一儀器廠產品，BioSpectrum 300凝膠成像系統為美國UVP公司產品，RT-6000雷杜酶標儀為深圳雷杜生命科學股份有限公司產品。

1.2TTF1-NP的制備依據參考文獻[7]，分別稱取處方量的Poloxamer 188、TTF1、脂酸和卵磷脂置于100 mL具塞錐形瓶中，加入適量的雙蒸水，于(74 ±3)℃ 水浴下，磁力攪拌溶解，分別構成水相及有機相。用注射器將有機相緩慢注入攪拌(1 000 r·min-1) 的水相中，得到半透明納米乳劑。將納米乳劑迅速加入至一定體積的攪拌的水相中( 0～2 )℃，繼續攪拌1 h，即得到TTF1- SLN混懸液。然后進行TTF1-SLN表征確定、包封率及體外釋放度的測定。

1.3細胞及培養HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和Chang Liver分別用含有10%小牛血清和1×105U·L-1DMEM培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中全濕常規培養。取對數生長期細胞用于下一步實驗。

1.4MTT法檢測TTF1-NP對多種細胞的生長抑制作用取對數生長期的HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和Chang Liver細胞，接種于96孔板中(6×103/孔)。培養24 h細胞貼壁后，分為50、100和200 μmol·L-1TTF1-NP實驗組，陰性對照組(DMEM常規培養)及陽性對照組(5-Fu 10 μmol·L-1)。分別培養24、48和72 h，加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，培養4 h，加入180 μL二甲基亞砜(DMSO)，測定570 nm處各孔內吸光度(A)值。細胞生長抑制率=(1-樣本平均A值/陰性對照組平均A值)×100%。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡按1.3實驗分組后，將各組細胞收集到15 mL離心管內，1 000 r·min-1離心5 min，冰PBS制成細胞懸液。細胞計數(保證每個樣本數大約1×106個細胞)。1 000 r·min-1離心5 min，棄去離心管內液體，用200 μL結合緩沖液重懸細胞，避光孵育室溫20 min，加入 Annexin V 10 μL，避光室溫靜止10 min。1 000 r·min-1離心5 min，棄去液體，重新加入結合緩沖液重懸細胞，每個樣本加入5 μL PI，避光孵育。上機檢測。采用FACSDiva 4.1 軟件對結果進行分析，結果以凋亡細胞百分率表示。

1.6Western blotting法檢測樣品GRP78和caspase-4蛋白表達提取1.4各實驗組全蛋白。陰性對照組和100 μmol·L-1TTF1-NP實驗組分別加入ERS 抑制劑4-PBA作用48 h后，提取陰性對照組、陰性對照加4-PBA組、100 μmol·L-1TTF1-NP實驗組和100 μmol·L-1TTF1-NP實驗組加4-PBA組的全蛋白。按照考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒說明書操作，計算各蛋白樣品濃度。制備相關分子質量的凝膠，加樣，電泳(80 V, 60 ～90 min)，轉膜(100 V，30～60 min)。取出膜浸泡在5% 脫脂奶粉中，室溫封閉2 h。加入抗體caspase-4 (1∶1 000) 和 GRP78 (1∶1 000) 4℃，過夜，PBS 清洗細胞，滴加二抗 (1∶5 000)，室溫2 h，PBS 清洗細胞。曝光，拍照。 應用Image J軟件對所得條帶進行灰度分析。

1.7免疫細胞化學法檢測樣品GRP78和caspase-4表達將各實驗組細胞清洗后，4% 多聚甲醛固定20 min，山羊血清室溫封閉30 min。濕盒內孵育一抗 caspase-4(1∶100)、GRP78 (1∶100) 4℃ 孵育過夜，PBS 清洗后加二抗(1∶1 000)37℃ 孵育2 h。適量 A 液與 B液等體積混合，細胞爬片內加入約100 μL 混合液，避光孵育 20 min。PBS 清洗細胞，二甲苯內浸泡 15 min，晾干，中性樹膠封片。

2　結　果

2.1TTF1-NP 制備長白山珍珠梅在乙酸乙酯回流多次提取、減壓濃縮、反復分離及氯仿-甲醇的梯度洗脫作用下，得到TTF1單體化合物。見圖 1。以硬脂酸為載體，采用乳化-低溫固化法最終制成平均粒徑為(195.2±35.2)nm和平均包封率為64.57%的TTF1-NP。

2.2MTT法檢測細胞生長抑制率不同濃度的TTF1-NP處理不同時間后，4種細胞生長均受到不同程度的抑制，且呈一定的濃度和時間依賴關系。人肝癌HepG-2細胞在相同作用時間內抑制率最高，達到72.6%，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；人正常肝細胞Chang Liver 細胞抑制較弱，與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。以下實驗選取人肝癌 HepG-2細胞為實驗對象。

圖15，2′，4′-三羥基-6，7，5′-三甲氧基黃酮單體化合物化學結構式

Fig.1Chemical structure of TTF1

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率陰性對照組細胞存活率為91.3%，凋亡率僅為4.9%。TTF1-NP實驗組和5-Fu組細胞的存活率逐漸下降、凋亡率逐漸上升。50、100和200 μmol·L-1TTF1-NP實驗組和陽性對照組凋亡率依次為：50.0%、86.2%、89.6%和90.1%，與陰性對照組(4.9%)比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2A和B。

2.4免疫細胞化學染色檢測ERS關鍵蛋白表達 經免疫細胞化學染色檢測，ERS起始反應信號蛋白GRP78及ERS特異性促凋亡蛋白caspase-4陰性對照組細胞呈多角形，結構正常，胞質棕色淡染，50 μmol·L-1TTF1-NP組細胞形態略有改變，100 μmol·L-1TTF1-NP組細胞變圓；200 μmol·L-1TTF1-NP組細胞數減少明顯，且核邊移，深染，固縮，細胞變小，胞質棕色深染。見圖 3(插頁二)。

2.5TTF1-NP 對 ERS 關鍵因子表達陰性對照組ERS反應起始蛋白GRP78和凋亡蛋白caspase-4均有表達，但表達量較低，隨著TTF1-NP劑量增加，GRP78和caspase-4表達水平顯著升高，與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4A和B。

2.6TTF1-NP 與 ERS 抑制劑對ERS關鍵因子表達陰性對照組GRP78、caspase-4蛋白與加入4-PBA后蛋白表達無明顯變化，TTF1-NP 實驗組GRP78、caspase-4 蛋白表達量增加，加入4-PBA后表達量明顯下降(P<0.05)，定性分析結果見圖5A，定量分析結果見圖5B。

表1TTF1-NP作用下人肝癌HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和Chang Liver細胞的生長抑制率

*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.

3　討　論

通過不同濃度(50、100和200 μmol·L-1)TTF1-NP分別處理人肝癌HepG-2、Hep3B、PLC/PRF/5和人正常肝Chang Liver細胞24、48和72 h結果顯示：TTF1-NP對4種細胞均有不同程度的抑制作用，有時間和濃度依賴性，對正常肝細胞Chang Liver抑制作用弱，對3種人肝癌細胞抑制作用均較強。流式細胞儀檢測結果：TTF1-NP可以誘導細胞凋亡，而且有一定的劑量依賴性，說明研究TTF1-NP抗腫瘤作用有一定的科學意義。

當ERS發生時，GRP78首先感知內質網腔內的壓力，并與內質網膜上的三大跨膜感受器蛋白PERK、ATF6和IRE-1解離、活化并大量表達[8-11]。caspase-12是ERS反應的特異性凋亡蛋白，只在ERS反應中被活化，當ERS強度過強或持續時間過長時，可以引起IRE1活化并募集內質網膜上的TRAF2，剪切無活性的caspase-12前體，生成活性caspase-12片斷，激活下游相關caspase家族成員，啟動caspase 家族級聯反應，促進凋亡。人體中caspase-12基因以其同源因子caspase-4形式表達，功能與鼠科類動物體內的caspase-12相同。Wang等[12]和Afrin等[13]研究發現：caspase-12/4可以作為ERS關鍵凋亡因子誘導細胞凋亡。Western blotting 和免疫細胞化學染色結果顯示:TTF1-NP導致人肝癌HepG-2細胞GRP78、caspase-4蛋白表達水平逐漸升高，表明ERS參與了 TTF1-NP誘導細胞凋亡過程。

A:Annexin-Ⅴ FITC/PI double-staining method;B:Apoptotic rate.

圖2Annexin-Ⅴ FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡

Fig.2Apoptosis detected by Annexin-Ⅴ FITC/PI double-staining method

A:Western blotting method;Lane 1:Vehiche group;Lane 2-4:50,100 and 200 μmol·L-1TTF1-NP groups;Lane 4:5-Fu group.B:Expression levels of GRP78 and caspase-4 proteins.

圖4Western blotting法檢測ERS關鍵蛋白表達

Fig.4Expressions of ERS key proteins detected by Western blotting method

A:Western blotting method;Lane 1:Vehiche group;Lane 2-4:50,100 and 200 μmol·L-1TTF1-NP groups;Lane 4:5-Fu group.B:Expression levels of GRP78 and Caspase 4 proteins.

圖5Western blotting法檢測4-PBA作用后ERS關鍵蛋白表達

Fig.5Expressions of ERS key proteins after treated with 4-PBA detected by Western blotting method

加入ERS抑制劑4-PBA后，4-PBA可以抑制TTF1-NP誘導活化的GRP78和caspase-4蛋白的表達，進一步證實了TTF1-NP可以通過活化ERS誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡。

本實驗通過檢測TTF1-NP誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡及ERS關鍵蛋白表達變化表明:TTF1-NP可以抑制人肝癌HepG-2細胞生長，ERS的活化是其作用機制之一。本課題組將針對TTF1-NP抗腫瘤作用機制進行深入研究。

[致謝：本文得到延邊大學醫學院鄭益星教授的大力幫助，在此致以謝意！]

[1]Chiu HW,Xia T,Lee YH,et al. Cationic polystyrene nanospheres induce autophagic cell death through the induction of endoplasmic reticulum stress[J].Nanoscale,2015,7(2):736-746.

[2]Maiese K.Programming apoptosis and autophagy with novel approaches for diabetes mellitus[J].Curr Neurovasc Res,2015,12(2):173-188.

[3]Xiao B,Cui LM,Ma DJ,et al.Endoplasmic reticulum stress in diethylnitrosamine induced rat liver cancer[J].Oncol Lett， 2014,7(1):23-27.

[4]金學英,汪步海.內質網應激與腫瘤[J].東南大學學報：醫學版,2013，32(1):110-114.

[5]Li Y,Cui FD,Bian L,et al.TTF1-induced apoptosis of HepG-2 cells through a mitochondrial pathway[J].Oncol Rep,2011,26(3):651-657.

[6]Liu C,Li XW,Cui LM,et al.Inhibition of tumor angiogenesis by TTF1 from extract of herbal medicine[J].World J Gastroenterol,2011,17(44):4875-4882.

[7]李妍，崔逢德，張學武.珍珠梅黃酮固體脂質納米粒的制備工藝[J].時珍國醫國藥，2012， 23(10)：2549-2550.

[8]Jiang X,Kanda T,Nakamoto S,et al.Knockdown of glucose-regulated protein 78 enhances poly(ADP-ribose) polymerase cleavage in human pancreatic cancer cells exposed to endoplasmic reticulum stress[J].Oncol Rep,2014,32(6):2343-2348.

[9]Li K,Han X.Endoplasmic reticulum stress is involved in the lidocaine-induced apoptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].J Mol Neurosci,2015,56(1):12-130.

[10]韓英，朱疆依.肝硬化并發肝癌危險因素篩查及綜合治療[J].中國實用內科雜志，2013，33(9)：694-697.

[11]李鵬，丁惠國.肝癌危險因素及早診斷與篩查[J].中國實用內科雜志，2015，35(3)：193-195.

[12]Wang M,Meng XB,Yu YL,et al.Elatoside C protects against hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes through the reduction of endoplasmic reticulum stress partially depending on STAT3 activation[J].Apoptosis,2014,19(12):1727-1735.

[13]Afrin MR,Arumugam S,Soetikno V,et al.Curcumin ameliorates streptozotocin-induced liver damage through modulation of endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis in diabetic rats[J].Free Radical Res,2014,49(3):1-31.

Induction effect of TTF1-NP on human hepatoma cell apoptosis through ERS-mediated pathway

XIAO Bin,LIU Rongrong,LIU Bingtong,ZHANG Xuewu

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,College of Medical Sciences,Yanbian University,Yanji 133000,China)

Objective To explore the effects of different doses of 5,2′,4′-trihydroxy-6,7,5′-trimethoxyflavone nanoparticles (TTF1-NP) on the apoptosis of human hepatoma cells and human normal hepatocytes, and to explore their mechanisms through endoplasmic reticulum stress (ERS)-meditated apoptosis pathway. MethodsThe human hepatoma cell lines (HepG2,Hep3B and PLC/PRF/5) and human hepatocytes (Chang Liver) were used as cell model,and divided into vehicle,5-Fu and TTF1-NP treated groups with the concentrations of 50,100 and 200 μmol·L-1respectively. The inhibitory effects of TTF1-NP on the cell growth were assessed using MTT assay and the best inhibitory one (HepG-2) was selected as the main research cell lines.Flow cytometry was used to detect the TTF1-NP-induced apoptosis; Western blotting and immunocytochemistry were used to determine the expressions of ERS key proteins.Finally,the expressions of key proteins were detected by Western blotting after using the ERS inhibitor 4-PBA.ResultsCompared with vehicle group,the inhibitory rates of growth of 4 kinds of human hepatoma cells in different concentrations of TTF1-NP groups were increased(P<0.05 orP<0.01); moreover,the inhibitory effects of TTF1-NP were in a time- and dose-dependent manner.Compared with vehicle group,the apoptotic rates of the cells in TTF1-NP groups were increased in a dose-dependent manner(P<0.05 orP<0.01); the expression levels of ERS key proteins GRP78 and caspase-4 were increased with the increasing of the concentration of TTF1-NP(P<0.05 orP<0.01).The expression levels of ERS key proteins GRP78 and caspase-4 induced by TTF1-NP were inhibited by ERS inhibitor 4-PBA(P<0.05 orP<0.01).ConclusionTTF1-NP can induce the apoptosis of HepG2 cells; ERS pathway plays a central role in TTF1-NP-induced apoptosis of HepG-2 cells.

5,2′,4′-trihydroxy-6,7,5′-trimethoxyflavone nanoparticles; endoplasmic reticulum stress; apoptosis;liver neoplasms

1671-587Ⅹ(2015)06-1118-06

10.13481/j.1671-587x.20150604

2015-04-14

國家自然科學基金資助課題(81260655)；吉林省科技廳科技發展計劃項目資助課題(201215242)

肖斌(1988-)，女，吉林省大安市人，在讀醫學博士，主要從事分子腫瘤學方面的研究。

張學武，教授，博士研究生導師(Tel：0433-2435102，E-mail：zhangxuewu@ybu.edu.cn)

R735.7

A