血管性癡呆大鼠海馬齒狀回區D1受體的表達

萬　朋，高俊濤，王　丹，王　師，金清華

(1. 吉林醫藥學院生理學教研室，吉林 吉林 132013；2. 延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉 133002)

血管性癡呆大鼠海馬齒狀回區D1受體的表達

萬朋1，高俊濤1，王丹2，王師2，金清華2

(1. 吉林醫藥學院生理學教研室，吉林 吉林 132013；2. 延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉 133002)

目的： 觀察血管性癡呆(VD)模型大鼠海馬齒狀回(DG)區的多巴胺(DA)濃度及D1受體表達情況，并探討兩者間的關系。方法：選用12只Sprague-Dawley雄性大鼠，隨機分為VD組和假手術組，每組6只。利用雙側頸總動脈永久性結扎法制備VD大鼠模型，模型制備結束30 d后，利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測定海馬DG區細胞外液中的DA濃度，應用免疫組織化學法觀察海馬DG區D1受體的表達情況。結果：VD組大鼠海馬DG區細胞外液中的DA濃度較假手術組明顯降低(P<0.05)。在VD組和假手術組大鼠的海馬DG區顆粒細胞層均有D1受體的表達，2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；而2組大鼠海馬門區均有D1受體的表達，VD組D1受體表達水平明顯升高(P<0.05)。結論：VD模型大鼠海馬DG區的DA濃度減少，其功能可能是通過海馬門區D1受體的表達增加而代償的。

血管性癡呆；海馬齒狀回；受體，多巴胺D1；大鼠，Sprague-Dawley

血管性癡呆(vascular dementia,VD)最明顯的病理學改變是小血管病變導致的海馬、尤其是海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區大量神經細胞的脫失[1-2]。VD的認知障礙包括對空間的認知和記憶障礙[3]，研究[4-5]表明：損壞海馬DG區的大鼠在完成空間參考記憶和工作記憶的任務時出現空間認知障礙。多巴胺(dopamine，DA)與學習記憶功能有密切的關系[6]，而且有證據[7]顯示：D1受體存在于海馬背側DG區的顆粒細胞和下腳復合體的絕大多數細胞內。研究[8-9]顯示：海馬內的DA可調控學習與記憶過程，可是這些研究主要集中在海馬的CA1區和CA3區，對VD模型大鼠海馬DG區的DA濃度及其D1受體的表達有何變化目前尚未見相關報道。因此，本實驗在清醒自由活動大鼠的整體水平上，觀察VD大鼠海馬DG區DA濃度的變化，并應用免疫組織化學法檢測D1受體在海馬DG區的分布和表達情況，探討海馬DG內的DA及其D1受體在VD空間學習記憶中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器選用12只成年雄性Sprague-Dawley系大鼠，體質量250～300 g，由延邊大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(吉)2011-0007。動物隨機分為假手術組(n=6)與VD模型組(n=6)。甲醇(美國TEDIA公司)，水合氯醛(天津市大茂化學儀器供應站)， 氨基丁酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸(美國Sigma公司)，兔抗鼠c-Fos多克隆抗體(SC-52)(美國Cell Signaling公司)，山羊抗兔IgG、Regent A、Regent B、封閉用正常羊血清原液及濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。HTEC-300型生物活性物質微量分析系統、ESP-64型微量灌流泵、EAS-20 自動進樣器、CA-5ODS型高效液相分離柱和SI-300型手動進樣器(日本EICOM公司)，8R-6型腦立體定位儀(日本成茂公司)。

1.2VD大鼠模型的制備大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg·kg-1)進行麻醉，在大鼠頸部正中線左側0.5 cm處做一個長約1 cm的切口，分離頸總動脈后用醫用4號手術絲線雙重結扎。7 d后于頸正中線右側0.5 cm處做一個長約1 cm的切口，雙重結扎右側頸總動脈。假手術組除了不結扎雙側頸總動脈，其余步驟均與VD組相同。模型制備完成25 d后，通過5 d的Morris水迷宮實驗觀察大鼠的空間學習記憶能力，以空間學習記憶損害作為判定模型制備成功的標準[10]。利用腦部微量透析法和高效液相色譜(HPLC)法測定海馬DG區細胞外液中DA濃度；利用免疫組織化學法檢測海馬DG區D1受體的分布和表達情況。

1.3微量透析探針的埋入模型制備完成30 d后，大鼠用10%的水合氯醛(300 mg·kg-1)行腹腔麻醉，根據Paxinos和Watson圖譜進行腦部定位，以前囟為參考點，將透析用外套管垂直插入并固定于一側海馬高于DG區1.0 mm的位置(定位坐標為：AP 3.2 mm，L/R 1.6 mm，H 2.5 mm)。適應環境24 h后，將微量透析探針通過外套管插入到DG區。

1.4海馬DG區DA濃度測定微量透析探針連接于數碼式微量泵，灌流人工腦脊液(1.5 μL·min-1)，穩定60 min后,經自動收集器收集微量透析樣本， 每管樣本收集10 min，共收集3個管,取平均值。收集樣本注入到生物活性物質微量分析系統內，以0.5 μL·min-1的速度通過HPLC分離柱和電化學檢測器，測定各個樣本中DA濃度。

1.5免疫組織化學法灌注、取材、切片：采用10%水合氯醛腹腔麻醉，從大鼠左心室快速注入4℃生理鹽水500 mL灌流沖洗，之后以4%多聚甲醛(pH 7.4)500 mL灌注固定。固定結束后，迅速在DA冰上斷頭取腦并置于4%多聚甲醛中浸泡固定2 h，其后置于20%蔗糖溶液中過夜直至下沉，再置于30%蔗糖溶液中過夜。將包含海馬的腦組織用石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，常規免疫組織化學法進行海馬DG區D1受體的染色。D1受體陽性細胞的計數方法：40倍光學顯微鏡下，在每只大鼠DG區的相應部位隨機取 5個視野照相，并在顆粒細胞層和多形細胞層各自選取10 000 μm2的領域，利用數字圖像分析系統對D1受體強陽性細胞進行計數。

2　結　果

2.1VD模型大鼠海馬DG區DA濃度VD組模型制備成功30 d后，應用腦部微量透析法和HPLC法測定海馬DG區細胞外液中DA濃度。如圖1的典型色譜圖所示，VD大鼠海馬DG區透析樣本中的DA波形與假手術組比較明顯降低。VD組海馬DG區細胞外液中DA濃度為(0.75±0.11) μg·L-1，而假手術組DG區DA濃度為(0.21±0.03) μg·L-1，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

A：Sham operation group；B：VD group.

圖1海馬DG區微量透析樣本中DA濃度檢測的典型HPLC圖

Fig.1Typical HPLC of DA in dialysate of hippocampal DG

2.2VD大鼠海馬DG區D1受體表達情況采用免疫組織化學染色法觀察海馬DG區D1受體的表達情況。在每次染色過程中未加一抗的陰性對照切片均未出現明顯的棕色顆粒。D1受體在DG的顆粒細胞層和多形細胞層均有表達(圖2，見插頁二)，且2個部位表達情況不盡相同。在顆粒細胞層和多形細胞層各自選取10 000 μm2的領域，進行D1受體強陽性細胞的計數。結果發現：在DG區顆粒細胞層，VD模型組D1受體強陽性細胞數為(33.85±2.12)個，與假手術組[(29.14±3.33)個]比較差異無統計學意義(P>0.05)；而在DG區多形細胞層(海馬門區)，VD模型組D1受體強陽性細胞數為(29.71±2.02)個，較假手術組[(24.57±1.36)個]明顯增加(P<0.05)。

3　討　論

DA是腦內重要的神經遞質，海馬不僅接受多巴胺神經元的投射[11]，而且DA與海馬空間學習記憶活動關系密切[12]。研究[12-13]表明：海馬內灌注DA受體阻斷劑可影響空間學習和被動回避反應的形成，而不影響已經形成的記憶。已被證實的中樞神經系統內DA能受體分為5種亞型，即D1～D5受體，其中D1受體在學習記憶中的作用備受關注[14-15]。研究[16-17]表明：海馬CA1和CA3區的D1受體在各種學習記憶活動以及學習記憶相關的突觸效應長時程增強(long-term potentiation,LTP)的形成和維持中起重要的調節作用。海馬DG內也存在D1和D2受體，且以D1受體為主[7]，海馬DG內的DA可通過激活D1受體易化大鼠的空間學習記憶活動。因此，本文作者提出海馬DG內的DA及其D1受體參與VD大鼠空間學習記憶損害的可能性。本實驗結果顯示：VD模型大鼠DG區DA濃度明顯減少，提示DA濃度的減少可能是VD大鼠空間學習記憶損害的原因之一。

眾所周知，信息在海馬內的傳遞過程大致為：內嗅皮層的穿通纖維投射到DG區顆粒細胞，顆粒細胞經苔蘚纖維投射到CA3區錐體細胞，后者再發出Schaffer側支投射到CA1區的錐體細胞，而海馬門是從DG顆粒細胞到CA3區錐體細胞的主要區域。本實驗結果顯示：VD模型大鼠海馬DG區D1受體表達在顆粒細胞層未出現異常，但在DG多形細胞層(即海馬門)內卻出現表達明顯增加。海馬門是從DG顆粒細胞到CA3區錐體細胞的主要區域，其中存在著大量的GABA能抑制性中間神經元，其可以通過調節顆粒細胞的活動影響海馬內的信息傳遞，而研究[18]發現：DA及其D1受體可通過影響GABA能中間神經元的活動來參與DG區空間信息處理過程。因此本文作者認為：VD大鼠海馬門區D1受體表達增加是對海馬區缺血的一種代償反應，以D1受體增加來部分代償VD大鼠DG區因DA減少而導致的信息傳遞的減弱。雖然本實驗結果還提示D1受體在海馬門區的作用對VD認知功能障礙的改善可能有積極的作用，但其具體的下游機制有待于進一步研究。

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Expression of dopamine D1 receptors in hippocampal dentate gyrus in rats with vascular dementia

WAN Peng1,GAO Juntao1,WANG Dan2,WANG Shi2,JIN Qinghua2

(1. Department of Physiology,Jilin Medical University,Jilin 132013,China; 2.Department of Physiology and Pathophysiology,College of Medical Sciences,Yanbian University,Yanji 133002,China)

Objective To observe the extracellular content of dopamine (DA) and expression of D1 receptors in hippocampal dentage gyrus (DG) in the model rats with vascular dementia (VD),and to investigate the relationship between them.Methods 12 male SD rats were randomly divided VD group and sham-operation group,and the VD model was prepared by permanent bilateral carotid occlusion.The extracellular content of DA in the DG was determined byinvivomicrodialysis and HPLC,and the expression of D1 receptors was measured by immunehisto- chemistry.ResultsThe DA content in the DG of the rats in VD group was lower than that in sham-operation group (P<0.05).The number of D1 receptor-positive cells in the DG hilus in VD group was increased compared with sham-operation group (P<0.05),whereas the expression of D1 receptor in DG granule cell layer did not change (P>0.05).ConclusionThe DA content in the hippocampal DG is decreased in the VD rats,and its function may be compensated by the up-regulation of D1 receptors in the DG hilus.

vascular dementia; dentate gyrus; receptors,dopamine D1;rats,Sprague-Dawley

1671-587Ⅹ(2015)06-1130-04

10.13481/j.1671-587x.20150606

2015-03-17

國家自然科學基金資助課題(31160211)

萬朋(1980-)，男，吉林省農安縣人，講師，理學博士，主要從事神經生理學方面的研究。

金清華，教授，博士研究生導師(Tel:0433-2435131,E-mail:yqinghua@ybu.edu.cn)

R743；Q427

A

網絡出版時間:2015-11-11 16:30:38

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20151111.1630.005.html