鍵合靶向納米膠束對腦膠質瘤細胞的組織相容性和靶向性

韓海玲，苗　壯,岳　軍，趙長福,景遐斌,金順子，王占峰,

(1.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，吉林 長春130021；2. 北華大學附屬醫院，吉林吉林 132011；3.吉林大學中日聯誼醫院神經外2科，吉林 長春 130033；4.中國科學院長春應用化學研究所 高分子物理與化學國家重點實驗室，吉林 長春 130022 )

鍵合靶向納米膠束對腦膠質瘤細胞的組織相容性和靶向性

韓海玲1，2，苗壯3,岳軍4，趙長福2,景遐斌4,金順子1，王占峰2,3

(1.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，吉林 長春130021；2. 北華大學附屬醫院，吉林吉林 132011；3.吉林大學中日聯誼醫院神經外2科，吉林 長春 130033；4.中國科學院長春應用化學研究所 高分子物理與化學國家重點實驗室，吉林 長春 130022 )

目的：探討轉鐵蛋白受體的單克隆抗體(OX26)與聚乳酸聚乙二醇(PEG-PLA)鍵合靶向納米膠束(copolymer/OX26)的生物相容性和安全性，闡明其作為腦膠質瘤靶向治療載體的可行性。方法：體外培養C6膠質瘤細胞，用不同濃度(10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)納米膠束作為實驗組，不含膠束的培養液作為對照組；臺盼藍染色法檢測靶向納米膠束對膠質瘤C6細胞的增殖抑制作用；流式細胞術檢測靶向納米膠束作用后C6膠質瘤細胞凋亡和細胞周期變化；激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細胞對靶向膠束的攝入情況。結果：與對照組比較，OX26靶向納米膠束作用后C6細胞數無明顯改變(P>0.05)， 各組細胞凋亡率和細胞周期細胞比例差異亦無統計學意義(P>0.05)；靶向納米膠束組細胞內的熒光強度明顯高于空白膠束組和空白對照組(P<0.05)，并且這種作用隨藥物作用時間和濃度的增加而增加。結論：OX26靶向納米膠束對C6細胞增殖和凋亡無影響，鍵合OX26提高了C6細胞對膠束的攝入量。

神經膠質瘤；靶向納米膠束；轉鐵蛋白受體；組織相容性

腦膠質瘤是顱內常見腫瘤，發病率占顱內腫瘤的40%。紫杉醇(paclitaxel， PTX)等多種一線新型抗腫瘤藥物對治療多種腫瘤有效，但因血腦屏障的存在限制其在顱腦疾病中的應用[1-2]。因此，尋找有效的藥物載體成為目前腦膠質瘤化學治療研究的熱點。研究[3]表明:轉鐵蛋白受體(transferring recepter,TfR)存在于腦BBB細胞壁上，借助TfR介導的內吞途徑，轉鐵蛋白(transferrin，Tf)能順利通過BBB細胞。但Tf是血漿中主要的含鐵蛋白質之一，且與BBB細胞上TfR的結合接近飽和，留給外源藥物——Tf復合物的機會很少。因此Tf自身不適于作為藥物轉運載體。研究者利用分子生物學手段，制備出多種TfR的單克隆抗體，如OX26就是其中之一，其與TfR能發生特異性地識別和結合，借助于TfR介導的內吞途徑，OX26能順利通過BBB細胞。而且，OX26與TfR的結合位點不同于Tf與TfR的結合位點，因而OX26和Tf間不存在互相競爭和抑制，大量內源Tf的存在不影響對OX26/藥物復合物的轉運。因此有研究者[4-5]用OX26作為藥物載體，向中樞神經系統轉運藥物。本課題組率先與中國科學院長春應用化學研究所景遐斌研究員合作，通過化學鍵合的方法，將轉鐵蛋白受體單克隆抗體OX26與PEG-PLA鍵合成靶向納米膠束(copolymer/OX26)，有望改變傳統化療藥物的理化特性，其作為腦靶向藥物載體具有廣闊的應用前景。目前，關于納米材料的生物安全性、生物效應及對人體健康的潛在影響也逐漸受到重視[6]。因此，本研究從OX26-聚乳酸聚乙二醇(PEG-PLA)納米膠束對腦膠質瘤靶細胞的影響及生物學效應方面進行探討，為鍵合靶向納米膠束作為顱腦腫瘤靶向藥物載體的生物效應及安全性進行分析，為進一步臨床應用奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器大鼠C6膠質瘤細胞系(C6細胞)由吉林大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室提供。培養基：RPMI 1640 (Sigma公司， 美國) + 10% (體積比)熱滅活小牛血清 + 青霉素100 U·mL-1+ 鏈霉素100 U·mL-1,pH為7.2～7.3,過濾消毒。小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產品。青霉素和鏈霉素由華北制藥廠生產。化學鍵合紫杉醇即PEG-PLA/PTX自制：10 mg PEG-PLA/PTX溶解于5 mL DMF 中，置于透析袋中,用1 000 mL 二次蒸餾水透析24 h，每4 h更換1次雙蒸水。透析完成后離心，取上清，冷凍干燥，置4℃保存。混合膠束表面鍵合單克隆抗體(OX26)：首先利用Trauts試劑在抗體上引入自由巰基，然后巰基化的抗體與表面含馬來酰亞胺的混合膠束在溫和條件下通過Michael加成反應固定在膠束表面(中國科學院長春應用化學研究所提供)。原料藥紫杉醇購自西安寶賽生物科技有限公司。二氯甲烷(DCM)為分析純，購自北京化工廠。乙腈為色譜純，購自上海復旦化學試劑有限公司。二次蒸餾水，使用SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)制備。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，配制濃度為0.01 mol·L-1(pH7.4)。透析袋為醋酸纖維素材質，截流相對分子質量35 000。FV 1000型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)。

1.2臺盼藍染色實驗消化對數生長期的C6細胞，制成2×105mL-1細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔100 μL懸液(2×104個細胞)，分別加入200 μL濃度為0(空白對照組)、10、20、40和80 mg·L-1的空白OX26-PEG-PLA(相當于PTX濃度為0、10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)/RPMI 1640溶液，培養1、2、3、4和5 d，采用臺盼藍染色法檢測各組的細胞數，觀察載體材料OX26-PEG-PLA的細胞毒性。

1.3流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期消化C6細胞，以5×105mL-1細胞懸液接種25 cm2培養瓶，24 h后更換培養液，分別加入PTX濃度為0、40.0和80.0 g·mL-1濃度的OX26-PEG-PLA膠束/RPMI 1640溶液，此時間點被稱為第0天。在第3天分別收集各組細胞，加入0.5 mL冰冷的70%乙醇中， -20℃冰箱保存。將制備好的單細胞懸液以1 000 r·min-1離心10 min,棄去固定液，冷PBS漂洗2次(1 000 r·min-1,5 min)，調整細胞為1×109L-1，加入PI染液1.0 mL，避光染色30 min，上機分析，用ModFit 軟件收集、貯存和分析數據，獲得各組細胞的凋亡率和各細胞周期的細胞分布情況。見表1。

1.4激光共聚焦顯微鏡檢測標記的膠束與C6細胞作用后細胞內的熒光強度用1% PBS緩沖液沖洗預先接種在蓋玻片上的C6細胞3次，加1.25 mg·L-1熒光標記膠束(由中國科學院長春應用化學研究所制備)，各組分別為：空白對照組、空白膠束、OX26-PEG-PLA-DHC/20 mg·L-1、OX26-PEG-P(LA-DHC/40 mg·L-1)，37℃避光孵育特定時間，洗滌細胞，3.7%多聚甲醛固定12 min,PBS洗片,50 μL PBS/甘油混合溶液(體積比1∶1)封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察(TRITC的激發波長為550 nm，發射波長620 nm) 。

2　結　果

2.1C6膠質瘤細胞形態學倒置顯微鏡觀察可見腫瘤活細胞形態基本一致：經80 mg·L-1空白納米膠束處理72 h的細胞可見細胞排列整齊，細胞大小形態趨向一致。與對照組比較,細胞核/質比例無明顯變化。見圖1。臺盼藍染色結果：納米膠束作用后，實驗組與對照組細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)。10、20、40和80 mg·L-1濃度的各空白OX26-PEG-PLA處理組細胞數隨著時間的增加而增加，與空白對照組細胞數相似；與對照組和作用1 d比較，作用5 d各實驗組細胞明顯增殖(P<0.05)，但各實驗組間兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

A：Control group (24 h);B：80 mg·L-1copolymer micelles group (24 h)；C：Control group (72 h); D：80 mg·L-1copolymer micelles group (72 h).

圖1倒置顯微鏡觀察各組C6細胞形態學表現(×200)

Fig.1Morphology of C6 glioma cells in various groups observed with inverted microscope (×200)

2.2各組細胞凋亡率和細胞周期變化40 mg·L-1PEG-PLA、10和40 mg·L-1OX26膠束作用72 h后,C6細胞凋亡率與對照組比較未見明顯改變(P>0.05)。與對照組比較，OX26-PEG-PLA-DHC/作用后G0/G1、S和 G2/M細胞周期的C6細胞比例未見明顯改變(P>0.05)。見表2。

表1　各組不同時間C6細胞數

表2　各組C6細胞凋亡率和細胞周期

2.3各組C6細胞對熒光標記膠束的攝入量激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況并計算熒光強度值，如表3所示。靶向膠束作用2 h的熒光強度高于作用1 h(P<0.05)；40 mg·L-1組強度明顯高于20 mg·L-1組(P<0.05)；靶向膠束組熒光強度明顯高于膠束組(P<0.05)。

表3各組C6細胞中攝入藥物的熒光強度

*P<0.05 compared with 1 h;△P<0.05 compared with OX26-PEG-PLA-DHC/PTX/20 group;#P<0.05 compared with PEG-PLA-DHC/PTX/40 group.

3　討　論

研究[7-8]表明:由于血腦屏障的存在限制了化療藥物在腦腫瘤治療中的應用。紫杉醇作為目前治療多種腫瘤有效的一線化療藥物，由于其溶解度低，透過血腦屏障差限制了其在腦膠質瘤治療中的應用。藥物如何透過血腦屏障成為目前研究熱點。

納米膠束(粒徑一般小于100 nm)作為一種新型藥物釋放載體，具有粒徑分布均勻、載藥范圍廣、結構穩定、體內滯留時間長、載藥量高和可透過血腦屏障等獨特的體內分布特點，同時可通過表面修飾鏈接不同靶向基元，實現膠束藥物的腫瘤靶向作用。作為理想的靶向載藥納米材料應具有鍵合藥物包封率高、擔載藥物能夠滿足治療的需要、較強靶向性、組織相容性好和易控制的藥物釋放過程[9-10]等特點。

本研究制備的納米膠束具有抗癌藥增容(PTX在水中的溶解度約1 mg·L-1)、抗癌藥保護和可控釋放，將PTX包裹在膠束的芯層，OX26處于膠束的最外層。靶向基元在外面是實現靶向的需要，但是OX26是一種蛋白質，在血液環境和組織環境中，容易受到人體免疫系統的攻擊，被攔截， 甚至被清除，所以將OX26鍵合在聚合物的疏水端(段),得到PEG-PLA-OX26，由于OX26是親水的，相當于一個三嵌段聚合物,使OX26受到PEG鏈段的保護，但OX26仍然處在水環境中，可與TfR接觸，保持靶向功能。為了調節OX26在納米膠束中的位置，擬選用不同長度的間隔基(spacer)將OX26鍵合在PEG-PLA的親水端，即形成OX26-PEG-PLA和(或)OX26-PEG-PLA-PTX 2種鍵合物，實現對OX26蛋白質的保護，又不妨礙OX26靶向功能的發揮[11-12]。

本研究通過將轉鐵蛋白受體單克隆抗體OX26作為靶向基元，PEG-PLA為載體構建擔載紫杉醇的靶向納米膠束，利用OX26介導的內吞，將抗癌藥物送入膠質瘤細胞，通過激光共聚焦顯微鏡檢測證實OX26可提高膠質瘤對納米膠束的攝入量，從而實現將化療藥物輸送到腦膠質瘤細胞，實現嚴格意義上的腦膠質瘤的瘤細胞靶向。通過MTT檢測證實：OX26靶向納米膠束對膠質瘤細胞增殖無影響，未見明顯不良反應，表明OX26-PEG-PLA-DHC納米膠束對腫瘤細胞生長無影響。細胞凋亡是通過基因調控的細胞自殺現象,在正常組織分化和腫瘤治療中具有重要意義,腫瘤的治療在某種程度上就是誘導腫瘤細胞凋亡的過程[13-14]。抗腫瘤藥物的抑瘤作用多是通過減少細胞的有絲分裂、促進細胞凋亡實現。本研究中流式細胞術檢測結果表明：膠束含量的增加對腫瘤細胞的凋亡率和細胞周期無影響。理想的腫瘤靶向藥物除具有良好的細胞相容性，還應具有良好的細胞靶向性，激光共聚焦檢測顯示：鍵合轉鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)后能明顯提高C6膠質瘤細胞對膠束的靶向攝入[14-16]。

綜上所述，通過鍵合的方法將轉鐵蛋白受體單克隆抗體-OX26鍵合到PEG-PLA 作為骨架的納米膠束上，可增加細胞對藥物的攝入量，且空白膠束對腦膠質瘤細胞增殖無明顯影響，有較好的生物相容性，可能成為腫瘤細胞靶向治療載體。

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Biocompatibility and brain-targeting ability of nano-micelles on glioma cells

HAN Hailing1，2, MIAO Zhuang3,YUE Jun4,ZHAO Changfu2,JING Xiabin3，JIN Sunzi1,WANG Zhanfeng2,3

(1.Key Laboratory of Radiobiology,Ministry of Health School of Public Health,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Affliatted Hospital, Beihua University,Jilin 132011,China;3.Department of Neurosurgery,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China;4.State Key Lab of Polymer Physics and Chemistry,Changchun Institute of Applied Chemistry, Changchun 130022,China)

ObjectiveTo investigate the biocompatibility and safety of nanoscale brain-targeting-carrier micelles[poly(ethylene)-b-poly(lactic acid) /OX26 conjugate micells(copolymer/OX26)],and to explore its possibility as brain-targeted-drug carrier for brain glioma.MethodsThe C6 glioma cells were culturedinvitroand divided into experimental groups with different concentrations (10,20,40，80 mg·L-1) of nano micelle,and the medium without micelle was used as control group.The inhibitory effect of nano-micelles on the rat brain glioma C6 cells was examined by Trypan blue cell counting assay.Flow cytometry (FCM) was used to detect the changes of apoptosis and cell cycle of C6 cells,and confocal laser scanning microscope (CLSM) was performed to analyze the distribution of copolymer/OX26 into C6 cells.ResultsThe results of Trypan blue cell counting assay showed copolymer/OX26 didn’t affect the growth of C6 cells,and there were no significant differences in the number of C6 cells between control group and expreimental groups(P>0.05).The results of FCM showed that the cell cycle and and the apoptotic rates of C6 cells had no changes compared with control group(P>0.05).The results of CLSM showed that the fluorescence intensities in experimental groups were higher than those in blank micelles group and blank control group(P<0.05),and they were increased in dose- and time-dependent manner(P<0.05).ConclusionCopolymer/OX26 has no effect on the growth and apoptosis of glioma cells.By bonding OX26, copolymer/OX26 can significantly increase the intake of C6 cells on the nano micelles.

glioma; brain-targeting-carrier micelles;transferrin receptor;histocompatibility

1671-587Ⅹ(2015)06-1134-05

10.13481/j.1671-587x.20150607

2015-05-05

國家自然科學基金資助課題(20904002)；教育部新世紀優秀人才計劃項目資助課題(NCET-10-0171)；吉林省科技廳青年基金資助課題(20130522020JH)；吉林省高技術產業發展專項資助課題(JF2012C005-2)；吉林省教育廳十一五重大課題(2009139)；吉林大學白求恩醫學科研支持計劃項目資助課題(2013107027)

韓海玲(1977-)，女，吉林省松原市人，副主任醫師，在讀醫學博士，主要從事腦血管病的生物治療和基礎方面的研究。

王占峰，副主任醫師，碩士研究生導師(Tel：0431-84995718，E-mail：1206hhl@sina.com)

R739.4

A

網絡出版時間:2015-11-11 16:30:34

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20151111.1630.002.html