OX-LDL介導內皮細胞損傷及其對TLR-4和EpCAM表達的影響

陳　為，張　葵，張宸豪，李　強，李　妍

(1.吉林醫藥學院檢驗學院免疫學教研室，吉林 吉林 132013；2.第四軍醫大學西京醫院臨床免疫科，陜西 西安 710032)

OX-LDL介導內皮細胞損傷及其對TLR-4和EpCAM表達的影響

陳為1，張葵2，張宸豪1，李強1，李妍1

(1.吉林醫藥學院檢驗學院免疫學教研室，吉林 吉林 132013；2.第四軍醫大學西京醫院臨床免疫科，陜西 西安 710032)

目的：研究氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)對血管內皮細胞的損傷效應及其對Toll樣受體4(TLR-4)和上皮細胞黏附分子(EpCAM)表達的影響。方法：培養人臍靜脈內皮細胞ECV-304，實驗分為對照組和實驗組(25、50、100和200 mg·L-1OX-LDL)，處理后細胞繼續培養24 h，臺盼藍拒染法檢測細胞活力；流式細胞術檢測活性氧(ROS)水平、線粒體膜電位(MMP)、細胞周期與凋亡以及EpCAM和TLR-4表達水平。結果：與對照組比較，25、50、100和200 mg·L-1OX-LDL組ECV-304細胞內ROS水平升高，細胞活力和MMP下降(P<0.05)。與對照組比較，25和50 mg·L-1OX-LDL組S期細胞百分率升高，而G0/G1期細胞略減少，SubG1期細胞(凋亡細胞)隨OX-LDL濃度增加而增加。與對照組比較，50 mg·L-1OX-LDL組24 h時ECV-304細胞膜表面TLR-4和EpCAM表達水平均明顯升高(P<0.05)。結論：OX-LDL具有提高內皮細胞ROS水平、降低細胞活力和MMP以及誘導細胞凋亡等損傷效應，此過程中ECV-304細胞中TLR-4和EpCAM水平升高。

氧化型低密度脂蛋白；血管內皮細胞；活性氧；上皮細胞黏附分子；Toll樣受體-4

血管內皮細胞覆蓋于血管內膜表面，不僅在維持血管滲透性和血壓調節中起關鍵作用，還通過分泌細胞因子、肽類激素和調節免疫黏附等機制參與免疫應答與炎癥反應[1]。血管內皮細胞損傷在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、高血壓、糖尿病和腦血管疾病等病理過程中起著重要作用[2]。常見導致血管內皮細胞損傷的因素包括內毒素脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、某些細菌的外毒素、體液中氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)、同型半胱氨酸、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)、末端晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNFs)等[3]。近年來，微炎癥(microinflammation)的概念被提出并引起重視。微炎癥是指以循環系統中炎性蛋白和炎癥性細胞因子輕度升高為特征的低強度、慢性炎癥狀態[4]。血管內皮細胞是微炎癥的損傷對象，血管損傷因素OX-LDL和Ang Ⅱ可通過對內皮細胞的影響參與微炎癥形成和維持。Ang Ⅱ可導致單核細胞表面的Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR-4)表達增加，增強LPS誘導單核細胞活化和細胞因子分泌[5]。OX-LDL是否在介導內皮細胞損傷同時也形成內皮細胞對外源血管損傷因素的高反應狀態尚不清楚，上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是一種細胞黏附分子，相對分子質量為40 000，具有314 個氨基酸，胞膜外區由242氨基酸組成[6]。EpCAM主要分布于正常上皮細胞間隙的緊密連接處，其細胞外區參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質以及免疫細胞與血管內皮細胞的黏附；EpCAM還與調控細胞增殖的Wnt和PI3K信號途徑相聯。EpCAM組成性表達在血管內皮單層上皮、白細胞表面以及胰腺和肝臟等組織細胞表面。LPS可上調白細胞表面EpCAM表達，但體液中的內源性血管損傷因素OX-LDL對血管內皮和白細胞EpCAM有何影響尚未見相關報道[7]。本研究將探討OX-LDL介導致血管內皮細胞損傷過程中，OX-LDL對TLR-4和EpCAM表達的影響，闡明微炎癥刺激對血管內皮細胞重要的模式識別受體和黏附分子表達的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑OX-LDL購自北京索萊寶科技有限公司，碘化丙啶(propidium iodide，PI)為美國Sigma-Aldrich公司產品，羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)和雙氯熒光黃乙酸乙酯(dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)購自上海碧云天生物技術研究所，RPMI 1640培養液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，兔抗人TLR-4抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人EpCAM抗體由第四軍醫大學免疫學教研室惠贈，FITC標記的羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗鼠IgG以及兔和鼠IgG購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2細胞培養自液氮中復蘇人臍靜脈內皮細胞ECV-304，在含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中培養，每周傳代3次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3活性氧(reactive oxygen species,ROS)分析接種細胞于6孔板，對照組加入含10%小牛血清RPMI 1640培養液，實驗組添加OX-LDL至不同終濃度(25、50、100和200 mg·L-1)，繼續培養24 h后收集細胞。PBS洗滌2次，100 μL PBS重懸細胞，加入DCFH-DA工作液，至其終濃度為5 μmol·L-1，混勻后在37℃避光反應30 min，PBS洗2次，400 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀分析。熒光探針DCFH-DA進入細胞后被酯酶水解為DCFH，繼而被ROS氧化而生成二氯氫化熒光素(dichlorofluorescin,DCF)，DCF熒光強度值可反映細胞內ROS水平。

1.4細胞活力分析收集對照組和不同濃度OX-LDL處理24 h的細胞，PBS洗2次后，PBS重懸細胞，取50 μL細胞懸液，加入等量0.4%臺盼藍染色液染色2 min，加入血細胞計數板，顯微鏡下計數細胞，計算活細胞百分率，即細胞活力。細胞活力=(拒染細胞總數/計數細胞總數)×100%。

1.5線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)分析收集對照組和不同濃度OX-LDL處理24 h的細胞，PBS洗2次后，加入濃度為1 μmol·L-1的Rh123染色工作液200 μL，37℃條件下反應30 min。洗滌細胞2次，用400 μL的PBS緩沖液重懸細胞，流式細胞術分析。若MMP下降，被線粒體吸附的Rh123減少，因此檢測Rh123發射平均熒光強度可代表MMP。

1.6細胞凋亡和細胞周期檢測OX-LDL(0和50 mg·L-1)處理細胞24 h，每組取1×106個細胞，PBS洗滌2次后用80%甲醇溶液固定細胞，置于-20℃保存。檢測前離心棄上清，PBS洗滌細胞2次，加入PI染液400 μL，室溫染色30 min后，流式細胞術分析細胞周期。

1.7細胞膜分子表達分析OX-LDL(0和50 mg·L-1)處理細胞24 h，收集細胞，用含1%牛血清白蛋白的PBS溶液重懸細胞，密度為5×106mL-1。取200 μL細胞懸液，加入TLR-4或兔IgG(同型對照抗體)，室溫反應30 min，PBS洗滌3次，加入FITC標記羊抗兔IgG抗體反應30 min；PBS洗滌2次，400 μL PBS重懸細胞。取200 μL細胞懸液，加入EpCAM抗體或鼠IgG(同型對照抗體)，室溫反應30 min，PBS洗滌3次，加入FITC標記羊抗鼠IgG抗體反應30 min，洗滌2次后400 μL PBS重懸細胞。流式細胞術分析同型對照(isotype)、TLR-4和EpCAM的表達。

2　結　果

2.1ECV-304細胞中ROS水平對照組和25、50、100、200 mg·L-1OX-LDL組細胞內熒光強度值分別為26.9±1.4、28.4±1.9、32.1±1.6、33.5±2.3和29.6±2.5。與對照組比較,不同濃度OX-LDL作用24 h，細胞內ROS水平均升高(P<0.05)。

2.2ECV-304細胞活力對照組和25、50、100、200 mg·L-1OX-LDL組活細胞百分率分別為(96.4±4.5)%、(95.3±4.6)%、(92.2±6.9)%、(86.9±7.2)%和(81.2±6.1)%。與對照組比較，OX-LDL組活細胞百分率隨OX-LDL濃度增加而下降(P<0.05)。

2.3ECV-304細胞MMPOX-LDL作用24 h，對照組和25、50、100、200 mg·L-1OX-LDL組MMP分別為22.8±1.5、21.6±1.3、19.1±1.8、17.0±1.9和12.3±2.1(圖1)。ECV-304細胞的MMP隨OX-LDL濃度增加而下降(P<0.05)。

A:Control group;B-E:25,50,100, and 200 mg·L-1 OX-LDL groups.

2.4ECV-304細胞周期和凋亡處理24 h后，細胞周期分析結果見表1。與對照組比較，25和50 mg·L-1OX-LDL組S期細胞百分率升高，而G0/G1期細胞略減少(P<0.05)；SubG1期細胞(凋亡細胞)隨OX-LDL濃度增加而增加(P<0.05)。

表1　 各組ECV-304細胞周期百分率

*P<0.05 compared with control group.

2.5ECV-304細胞中TLR-4和EpCAM的表達免疫熒光染色和流式細胞術分析TLR-4和EpCAM表達，結果見圖2和表2。50 mg·L-1OX-LDL作用24 h，ECV-304細胞膜表面TLR-4和EpCAM表達水平均明顯升高(P<0.05)。

A,D:Control group( Isotype);B:Control group(stained by TLR-4 antibody);C:50 mg·L-1OX-LDL group(stained by TLR-4);D:Control group (Isotype);E:Control (stained by EpCAM antibody);F:50 mg·L-1OX-LDL group(stained by EpCAM antibody).

圖2流式細胞術檢測各組ECV-304 細胞中TLR-4和EpCAM表達

Fig.2Expressions of TLR-4 and EpCAM in ECV-304 cells in various groups detected FCM

表2各組ECV-304細胞中TLR-4和EpCAM表達水平

*P<0.05 compared with control group.

3　討　論

高脂血癥是AS的重要致病因素，黏附于血管內皮細胞的單核細胞增多并遷入內皮下間隙，在攝取大量的脂蛋白后轉變成為泡沫細胞，泡沫細胞不斷在內皮間隙聚積，形成脂紋病變[8]。以往在細胞與分子水平對OX-LDL致病作用的研究主要集中于單核巨噬細胞。OX-LDL升高巨噬細胞內ROS水平，而ROS可啟動線粒體相關的凋亡轉導途徑，同時也誘導炎癥性細胞因子(如IL-6)、趨化因子和多種黏附分子的合成，形成炎癥反應的級聯放大效應[9]。OX-LDL也通過血管內皮參與AS，探討OX-LDL對血管內皮細胞的影響，對預防和治療AS等疾病具有重要意義。本研究結果表明：OX-LDL可導致內皮細胞ROS水平升高，高濃度OX-LDL組ECV-304細胞的活力和MMP明顯下降，細胞發生凋亡。低濃度OX-LDL可促進細胞增殖周期運轉，25和50 mg·L-1OX-LDL作用24 h，S期細胞百分率增加。血管內皮細胞需保持數目相對穩定，內皮細胞數目減少或過度增殖均影響血管正常結構與功能，因此低濃度OX-LDL促進細胞周期的效應也應引起注意。

OX-LDL在單核巨噬細胞和泡沫細胞表面的受體有多種，包括清道夫受體(cavenger receptors)如CD36分子、B族Ⅰ型清道夫受體、CD68分子和含成束蛋白的、表皮生長因子樣、層連蛋白型表皮生長因子樣和連接域清道夫受體1/2(fascicin，EGF like,laminin-type EGF-like and link domain-containing scavenger receptor 1/2, FEEF1/2)等[10]。上述受體可能在介導OX-LDL毒性、促進AS過程中發揮重要作用，但其在內皮細胞不表達或表達量很低。近年來發現的凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(LOX-1)是表達于內皮細胞的主要OX-LDL受體，LOX-1是一個多配基受體，除了結合OX-LDL外，還可結合末端晚期糖基化終末產物、C反應蛋白和熱休克蛋白等[11]。OX-LDL與LOX-1結合，可通過線粒體電子傳遞鏈等途徑誘導內皮細胞內ROS水平升高。而ROS可作為第2信使活化細胞內磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、細胞外調節激酶1/2(ERK1/2)和p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)等偶聯的信號通路。OX-LDL與LOX-1結合，可上調血管內皮黏附分子1(VCAM-1)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)等表達，介導單核細胞與內皮細胞的結合和遷移[12]。本研究中OX-LDL對ECV-304細胞ROS水平、細胞活力、周期和凋亡的影響與文獻報道一致，體現了LOX-1和其他OX-LDL受體介導的效應。

微炎癥是指循環系統以炎性蛋白、炎性細胞因子低幅度升高為特征的慢性炎癥狀態。AngⅡ參與微炎癥狀態，并與AS和糖尿病等慢性疾病關聯的觀點受到重視[13-14]。AngⅡ與其受體結合可導致血管平滑肌收縮，從而調節血壓平衡[15]。在嚴重創傷、失血性休克和燒傷等急性應激情況下，AngⅡ主要體現其對機體的保護性作用。但是上述疾病并發感染，尤其感染革蘭陰性菌后，內毒素對血管內皮的損傷作用嚴重。有學者將AngⅡ誘導微炎癥基礎上內毒素致病性加重的現象稱為“二次打擊”，是微炎癥參與疾病的具體表現。AngⅡ促進肺泡上皮細胞中TLR-4表達可能是形成該現象的重要原因[15-16]。本研究結果顯示：OX-LDL對TLR-4和EpCAM表達具有明顯的上調作用，2種膜分子均與免疫應答和炎癥反應關系密切。TLR-4是LPS的主要受體，表達于多種免疫細胞和血管內皮細胞[17]。本研究結果提示：OX-LDL也可能通過上調血管內皮細胞LPS受體的表達，形成微炎癥的狀態，與LPS形成協同作用，增強內皮細胞對外源炎癥刺激的反應，導致血管內皮系統損傷。

EpCAM(CD326)是近年來發現一種Ⅰ型跨膜蛋白，相對分子質量約為40 000，EpCAM的表達模式不同于其他細胞黏附分子，正常情況下僅表達于上皮組織，但在病理情況下在多種腫瘤和炎癥組織中表達。EpCAM的胞膜外區和胞漿區均具有重要功能，胞膜外區主要發揮黏附作用，參與免疫細胞和血小板黏附、遷移和相互作用；其胞漿區可以被切割并入細胞核，參與調控多種細胞周期相關基因的表達[18，6]。OX-LDL誘導對EpCAM表達的影響尚未見相關報道。本課題組發現：OX-LDL可上調EpCAM的表達，前期實驗還發現轉染EPCAM促進單核細胞與內皮細胞的黏附作用。

綜上所述，OX-LDL對TLR-4和EpCAM 2種膜分子具有上調效應，表明OX-LDL可能在介導血管內皮細胞損傷同時，也形成血管內皮細胞對LPS等外源血管損傷因素的高反應狀態。阻斷TLR-4和EpCAM是否可減輕血管內皮細胞在細菌感染等情況下的損傷，尚需要結合體內研究進一步探索。

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Damage of endothelial cells induced by OX-LDL and its influence in expressions of TLR-4 and EpCAM

CHEN Wei1，ZHANG Kui2，ZHANG Chenhao1，LI Qiang1，LI Yan1

(1.Department of Immunology,School of Medical Labrotary, Jilin Medical University，Jilin 132013，China；2.Department of Clinical Immunology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)

ObjectiveTo study the damage effect of oxidized low density lipoprotein (OX-LDL) on the endothelial cells and its influence in the expressions of Toll like receptor 4 (TLR-4) and epithelial cell adhesion molecule(EpCAM). MethodsThe human endothelial cells ECV-304 were culturedinvitroand treated by different concentrations of OX-LDL for 24 h, and the cell vitality was measured by Taipan blue rejection test.The reactive oxygen species(ROS) level,mitochondrial membrane potential(MMP)，cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry (FCM).The expression of TLR-4 and EpCAM were also analyzed by FCM. ResultsCompared with control group, the ROS levels in ECV-304 cells in 25,50,100, and 200 mg·L-1OX-LDL were increased，but the cell vitalities and MMP were decreased(P<0.05). Compared with control group, the percentages of S phase cells in 25 and 50 mg·L-1OX-LDL groups were increased，the G0G1phase cells were slightly reduced, and the SubG1phase cells (apoptotic cells) were increased with the increasing of OX-LDL concentration. Compared with control group, the TLR-4 and EpCAM expression levels in ECV-304 cells in 50 mg·L-1OX-LDL group at 24 h were significantly increased (P<0.05).Conclusion OX-LDL could increase the ROS level and induce the apoptosis in vascular endothelial cells,while increase the cell vitality and MMP.During the damage process, the expresion levels of TLR-4 and EpCAM are up-regulated.

oxidized low density lipoprotein；vascular endothelial cell；reactive oxygen species；epithelial cell adhesion molecule;Toll like receptor-4

1671-587Ⅹ(2015)06-1144-06

10.13481/j.1671-587x.20150609

2015-08-23

國家自然科學基金資助課題(82102953)；吉林省科技廳重大項目資助課題(20140203012YY)；吉林省科技廳中青年科技創新領軍人才及團隊項目資助課題(20130521018JH)；吉林省衛生廳項目資助課題(2012Z076)；吉林省中醫藥管理局重點項目資助課題(2014ZD30)

陳為(1986-)，男，河南省三門峽市人，在讀醫學碩士，主要從事非感染性炎癥的免疫機制方面的研究。

李妍，教授，碩士研究生導師(Tel： 0432-64560461，E-mail：13894212310@163.com)

R541.6

A

網絡出版時間:2015-11-11 16:30:32

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20151111.1630.001.html