RNA干擾血管緊張素原基因表達對前脂肪細胞3T3-L1分化的影響

黃志立，張麗君，伍麗華，王　妍，楊汝德

(1.深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510640)

RNA干擾血管緊張素原基因表達對前脂肪細胞3T3-L1分化的影響

黃志立1，張麗君1，伍麗華2，王妍1，楊汝德2

(1.深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510640)

目的：構建靶向血管緊張素原(AGT)基因的RNA干擾質粒，研究AGT基因對鼠前脂肪3T3-L1分化的影響。方法：設計靶向AGT的小分子RNA干擾片段(AGT-shRNA)，以未靶向任何DNA的小分子RNA(Non-shRNA)為對照，利用載體psiRNA-U6.1/Neo構建重組表達質粒，轉染鼠前脂肪細胞3T3-L1并篩選到穩定轉染細胞株，RT-PCR和SDS-PAGE法分別檢測AGT基因沉默效果，通過顯微鏡觀察和脂肪細胞分化標志物檢測來確定AGT基因干擾對3T3-L1細胞分化的影響。結果：成功構建AGT干擾質粒，與對照組比較，AGT基因轉錄水平受到顯著抑制(P<0.05)，AGT蛋白表達水平也僅為對照的43.86%。AGT基因干擾后3T3-L1細胞脂質水平和甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)活性仍隨分化時間延長呈上升趨勢，但增長量明顯低于對照組(P<0.05)。結論：RNA干擾AGT基因可明顯抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，提示脂肪組織中的腎素-血管緊張素系統(RAS)與脂肪代謝有重要關聯。

血管緊張素原；RNA干擾；3T3-L1；分化

腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)是人體內重要的體液調節系統，對穩定心血管系統功能、維持體液平衡和調節血壓有重要作用，與高血壓和糖尿病等疾病關系密切[1]。在RAS中，血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)是產生具有生物活性血管緊張素的前體物質，其在腎素和血管緊張素轉化酶催化下依次轉化為血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，AngⅡ是RAS最主要的生物活性肽，通過循環系統到達遠端組織，與心臟、血管、腎臟及腦組織等靶器官的特異性受體(angiotensin receptor，AT)結合，產生信號傳導而發揮其生理功能[2]。脂肪組織中表達RAS的所有組分，肥胖者同時伴有RAS的過度活躍，提示脂肪組織RAS與脂肪代謝及肥胖有密切關聯[1,3]。以往研究[4-8]主要針對RAS活性物質AngⅡ以及其受體AT1與AT2展開，卻得到相互矛盾的結果，部分研究[4-6]顯示提高AngⅡ水平會促進人和鼠前脂肪細胞分化，而另一些研究[7-8]結果卻表明RAS會抑制脂肪合成。為了排除RAS各組分間的相互影響，本研究以RAS的源頭AGT為目標，構建靶向鼠前脂肪細胞AGT基因的RNA干擾(RNAi)質粒，轉化3T3-L1細胞，通過沉默AGT基因來探討RAS對脂肪細胞分化增殖的影響，為研究RAS影響脂肪細胞分化的機制以及RNAi新技術的應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器鼠前脂肪細胞3T3-L1購自中國科學院廣州生物醫藥與健康研究所。質粒psiRNAT-U6.1/Neo購自GenScript公司，大腸桿菌TOP-10由本實驗室細胞服務平臺提供。限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、KpnⅠ，DNA和RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒SYBR○RPremix Ex TaqTM(Takara 公司，日本)；DMEM培養基和胎牛血清(Gibco公司，美國)，LipofectamineTM2000和TRIZOL(Life Technologies公司，美國)，DEX、IBMX、胰島素和DHAP(Sigma公司，美國)。二氧化碳恒溫培養箱(BINDER公司，德國)，酶標儀(Spectramax M2，美國)，倒置熒光相差顯微鏡(LEICA DMIRB公司，德國)，電泳及凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司，美國)，熒光定量PCR儀(Roche公司，德國)。引物合成和DNA測序委托上海生工生物工程公司完成。

1.2RNAi質粒的構建根據NCBI中查找到的小鼠AGT基因序列(NM 007428)，利用Ambion提供的在線siRNA模板序列設計軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)設計出2組靶向鼠AGT的siRNA序列，由于2組實驗結果相近，論文數據只選取其中一組，將其命名為AGT-shRNA。此外，還設計一條與NCBI數據庫中任何小鼠基因均無同源性的片段作為實驗對照，標記為Non-shRNA。根據質粒載體psiRNAT-U6.1/Neo的基因序列，整條序列應該分別包括BamHⅠ酶切黏性末端互補片段、19個堿基靶序列、LOOP環、19個堿基靶序列的互補序列、終止信號以及HindⅢ酶切黏性末端的互補片段共6個區域。用于構建重組干擾質粒的寡核苷酸序列見表1。

表1　用于構建重組干擾質粒的寡核苷酸序列

委托生工生物工程(上海)公司合成表1中的寡核苷酸片段，90℃加熱10 min，室溫靜置1 h，使之退火成雙鏈。PsiRNAT-U6.1/Neo載體經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切成線性載體，再經T4連接酶分別與AGT-shRNA和Non-shRNA片段連接，重組質粒轉化大腸桿菌TOP-10，篩選重組子，進行酶切分析和測序鑒定。

1.3穩定轉染3T3-L1細胞株的獲得及誘導分化鼠前脂肪細胞3T3-L1培養于含10%FCS的DMEM培養基中，按照每孔2×104個細胞接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞匯合至80%，更換無抗生素無血清DMEM培養基培養過夜。采用LipofectamineTM2000試劑，以每孔1 μg將重組質粒分別轉染入3T3-L1鼠前脂肪細胞株中，37℃培養。6 h后更換無抗生素DMEM培養基(含10%FCS)，37℃培養24 h。為了篩選穩定轉染的3T3-L1細胞，在培養基中加入抗生素G418至終濃度為600 mg·L-1，37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2 d換液，10～14 d后，可見有抗性的克隆出現，停藥培養，待其逐漸增大后，挑取單克隆增殖。對應重組質粒，將獲得的細胞株分別用AGT-shRNA和Non-shRNA表示。將細胞在普通DMEM培養基中37℃培養2 d(將此時的細胞狀態定義為0 d)，更換誘導分化培養基(無血清DEME培養基中含有0.5 μmol·L-1胰島素、0.25 μmol·L-1地塞米松和0.5 nmol·L-1IBMX)，37℃分別培養0～12 d，根據實驗需要在不同時間收獲細胞。

1.4RT-PCR法檢測AGT基因mRNA表達水平提取3T3-L1細胞總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit操作方法逆轉錄獲得cDNA，利用SYBR○RPremix Ex TaqTMKit進行RT-PCR，AGT基因的轉錄水平以管家基因β-actin為對照。其中擴增AGT基因的引物：上游引物，5′-GCTTGTCTAGGTTGGCGCTGA-3′； 下游引物，5′-CAGGTGCTCTTGTTGTGGTAAAGG-3′；擴增β-actin基因的引物：上游引物，5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′； 下游引物，5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′ 。PCR反應體系是20 μL，PCR循環反應條件：95℃、10 s，60℃(AGT)或56℃(β-actin)、10 s；72℃、10 s，實驗數據采用PCR儀配套軟件進行相對定量，AGT基因mRNA表達水平計算公式：2Ct(AGT,AGT-shRNA)-Ct(β-actin,AGT-shRNA)/2Ct(AGT,Non-shRNA)-Ct(β-actin,Non-shRNA)，轉染對照質粒的細胞AGT基因mRNA表達水平為100%，AGT基因干擾后其mRNA表達水平以相對于陰性對照的百分數表示。

1.5SDS-PAGE蛋白電泳檢測AGT蛋白表達水平分別用AGT-shRNA質粒和Non-shRNA質粒轉染3T3-L1細胞，同時進行無義轉染作為空白對照，48 h后收集3組細胞，用Bradford法檢測蛋白濃度。按照每孔20 μg的上樣量對樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結果經凝膠成像系統拍照后，采用Quantity One軟件進行蛋白條帶灰度的相對定量分析，結果以百分數表示。

1.6吸光光度法檢測3T3-L1細胞的分化水平通過檢測甘油-3-磷酸脫氫酶(glycerol phosphate dehydrogenase,GPDH)活性和胞內脂質水平反映前脂肪細胞的分化水平。分別在第4、8和12天收集細胞，培養6孔板，吸盡培養基，用PBS緩沖液沖洗細胞2～3次，每孔加入0.5 mL預冷的細胞超聲破碎液，刮下貼壁細胞，使用超聲破碎儀在冰浴中破碎30 s，4℃、12 000 g離心15 min，收集上清液至96孔板，并加入反應混合液(100 mmol·L-1三乙醇胺-HCl緩沖液， pH 7.5、2.5 mmol·L-1EDTA，0.12 mmol·L-1NADH和0.1 mmol·L-1β-巰基乙醇)，加入0.2 mmol·L-1DHAP啟動反應，以NADH的消耗速率測定GPDH活性。利用酶標儀在340 nm處檢測數據，蛋白水平測定采用Bradford法，GPDH活性以U·g-1蛋白表示(1 U=1 mol NADH/min)[9]。分別收集在轉染并誘導分化后第0、2、4、6、8、10和12天的3T3-L1細胞，用油紅O染色方法測定細胞脂質積累變化，具體方法如下：吸盡培養液，細胞用PBS洗3次后加入10%甲醛溶液，固定30 min，加入異丙醇漂洗，待異丙醇徹底揮發后加入300 μL油紅O，染色30 min，PBS沖洗3次，洗凈未著色染料，于倒置顯微鏡下觀察細胞分化程度，再加入250 μL異丙醇提取油紅O，振蕩10 min，取200 μL在波長500 nm處測吸光度(A)值，A值的大小直接反映細胞脂質水平，以此判定脂肪細胞的分化程度。

2　結　果

2.1RNAi質粒的酶切分析結果將AGT-shRNA和Non-shRNA基因片段(表1)分別與質粒psiRNA-U6.1/Neo重組，構建成重組質粒。將重組質粒分別用3種酶進行2組雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。質粒psiRNA-U6.1/Neo經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后會產生大小為6 029 和351 bp的2條片段，而重組質粒雙酶切后的2條片段大小分別為5 983和397 bp(圖1A)。未重組質粒經EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后會產生6 035和345 bp 2條片段，而重組質粒由于KpnⅠ酶切位點被外源基因所替換，雙酶切后只會產生一條大小為6 380 bp的片段(圖1B)，結果與預期相符。經上海生工生物工程公司測序，確定重組質粒已構建成功。

A：EcoRⅠ/HindⅢ; B：EcoRⅠ/KpnⅠ. M：100 bp ladder DNA marker；Lane 1：psiRNA-U6.1/Neo；Lane 2：AGT-shRNA； Lane 3：Non-shRNA .

圖1重組質粒的酶切分析電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of degestion of recombinant plasmids with restriction endonucleases

2.2RT-PCR法與SDS-PAGE檢測AGT基因mRNA及蛋白表達水平RT-PCR以β-actin作為本底對照， AGT基因干擾后其mRNA表達水平明顯降低(P<0.05),只有陰性對照的(53.00±0.08)%。AGT蛋白電泳結果經Quantity One軟件進行相對定量分析，得出AGT蛋白條帶的灰度相對量：無義轉染和陰性對照的AGT相對含量分別為總蛋白的7.12%和7.57%，結果接近，而AGT基因沉默組的AGT蛋白相對含量為總蛋白的3.32%，為陰性對照組的43.86%，見圖2。上述結果表明：AGT基因干擾后，mRNA轉錄及蛋白表達水平均受到抑制。

Lane 1：3T3-L1 group；Lane 2：Non-shRNA group；Lane 3：AGT-shRNA group；M:Protein marker.

圖2SDS-PAGE電泳檢測各組3T3-L1細胞中AGT蛋白表達電泳圖

Fig.2Electrophoregram of expressions of AGT protein in 3T3-L1 cells in various groups detected by SDS-PAGE

2.32組3T3-L1細胞的分化水平誘導分化開始后，前脂肪細胞內的GPDH活性不斷增加，并隨著分化進行逐漸增加，在脂肪細胞分化末期(第12天)GPDH酶活性達到峰值。AGT基因沉默后細胞GPDH活性仍然隨著分化時間的延長呈上升趨勢，但與對照比較其活性水平降低，尤其在第8和12天差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。細胞油紅染色檢測脂質水平：各組細胞的胞內脂質積累均在誘導第6天后迅速增加，但與對照比較，AGT基因抑制導致胞內脂質水平下降，其中第6和8天差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。2組誘導分化至第12天時細胞經油紅染色后在顯微鏡鏡下觀察，AGT基因沉默組細胞的脂質積累明顯弱于陰性對照。見圖5(插頁四)。

* P<0.05 vs Non-shRNA.

Fig.3Activities of GPDH in 3T3-L1 adipocytes after AGT gene silencing

* P<0.05 compared with Non-shRNA.

Fig.4Levels of lipids in 3T3-L1 adipocytes after AGT gene silencing

3　討　論

肥胖是繼心腦血管病和癌癥之后人類健康的第3大殺手。肥胖者往往伴有高血糖、高血壓和高血脂等代謝綜合征，并且是2型糖尿病的高危人群[1]。對脂肪組織中RAS的研究表明：該系統與脂肪細胞分化、積累、代謝，肥胖、高血壓和2型糖尿病等疾病等有密切關聯[10]，但其相關機制仍不明確。以往的研究表明：RAS會促進脂肪細胞分化，但也有完全相反的報道[1-3,11]。究其原因：首先,RAS對脂肪細胞的調控機制復雜，脂肪細胞產生的Ang Ⅱ對自身的作用即有自分泌和旁分泌等方式[12]；其次，各種生物活性因子之間相互影響，尤其是內源和外源RAS組分、脂肪來源與非脂肪來源的RAS組分之間相互影響[3]；此外，實驗方法的選用也可能是原因之一。在體外細胞實驗中，常采用外源添加Ang Ⅱ和(或)Ang Ⅱ受體阻斷劑的方法，但Huang等[13]在其研究中也質疑AT1受體阻斷劑可能會與Ang Ⅱ互相干擾，導致對脂肪細胞影響結果不明，因此合理的研究方法至關重要。 RNAi是一門新興技術，RNAi不是完全的基因敲除，而是通過小分子RNA來沉默目的基因，達到抑制、干擾其表達的目的，由于其具有操作方便、周期短和成本低等優點，已廣泛應用在功能基因組學、藥物篩選、細胞信號途徑和基因治療等研究領域[14-15]。本實驗室首次報道了將該技術應用在RAS對前脂肪細胞分化影響的研究中[16]，從而避免了前述各種外源添加因子相互干擾的現象。本課題組的前期研究[5-6]結果表明：外源添加Ang Ⅱ會促進3T3-L1分化和脂質積累，并上調多種相關轉錄因子的轉錄水平，在本研究中通過RNAi技術沉默AGT基因獲得了相似的結果。轉染了AGT-shRNA干擾質粒的3T3-L1細胞，其AGT基因mRNA和蛋白表達水平分別降低至對照的53%和43.86%，并且在分化過程中，細胞的GPDH酶活性和脂質水平也明顯降低。GPDH是產生甘油-3-磷酸的唯一催化酶，是甘油三酯合成的限速酶，而甘油三酯是細胞中脂質水平的重要指標，甘油三酯和酯質水平是前脂肪細胞分化成熟重要標志，其水平的降低說明前脂肪細胞的分化隨著AGT基因的沉默受到明顯的抑制，該結論與本課題組在人前脂肪細胞HPA-v中的研究結果一致[16]，證明AGT基因沉默對前脂肪細胞分化的抑制作用沒有種屬差異性，但其分子機制尚需研究。此外，本研究也驗證了利用RNAi技術建立目的基因沉默的體外細胞模型是一種有效的研究方法。

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Influence of angiotensinogen gene silencing on differentiation of preadipocytes 3T3-L1

HUANG Zhili1,ZHANG Lijun1,WU Lihua2,WANG Yan1,YANG Rude2

(1. School of Applied Chemistry and Biological Technology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055,China；2. School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Sciences and Technology,Guangzhou 510640,China)

Objective To construct the angiotensinogen (AGT)-targeting RNA interfering plasmids,and to explore the effect of AGT gene on the differentiation of preadipocytes 3T3-L1 in the mice.MethodsThe small hairpin RNA (AGT-shRNA) interference plasmids,with a scrambled Non-shRNA as control,were constructed on the basis of the activity of U6 promoter-driven expression vector psiRNA-U6.1/Neo and transfected into the mouse preadipocytes 3T3-L1.Two cell lines were generated from stable transfections.RT-PCR and SDS-PAGE were performed to monitor the mRNA and protein expressions of AGT gene, respectively.The effect of adipose AGT on the differentiation of 3T3-L1 was investigated through microscopic observation and profiling of adipocyte differentiation markers.ResultsBoth AGT-shRNA and Non-shRNA interference vectors were successfully constructed; the expression of AGT mRNA was inhibited(P<0.05)and the expression of AGT protein was 43.86% of control.Both adipocyte differentiation markers,intracytoplasmic lipid levels and glycerol-3-phophate dehydrogenase (GPDH) activities were increased during the differentiation of preadipocytes 3T3-L1,but the data were lower than those in control group(P<0.05).ConclusionAGT gene silencing can significantly inhibit the differentiation of preadipocytes 3T3-L1,which demonstrates that there is important relationship between adipocyte metabolism and renin-angiotensin system (RAS) in adipose tissue.

angiotensinogen; RNA interference; 3T3-L1; differentiation

1671-587Ⅹ(2015)06-1195-06

10.13481/j.1671-587x.20150619

2015-04-21

廣東省教育廳產學研結合項目資助課題(2012B091100408)；深圳市科技計劃項目資助課題(07KJba160);廣東省深圳市創新委新興產業公共技術服務平臺項目資助課題(GGJS20130331152344401)

黃志立(1974-)，女，四川省興文縣人，副教授，工學博士，主要從事生物技術應用方面的研究。

張麗君，副教授(Tel:0755-26019560,E-mail:c7zlj@szpt.edu.cn)

R34；R329.28