超聲彈性成像定量指標和半定量評分與乳腺腫瘤成纖維細胞分布的關聯性分析

劉　焱，郭　君，齊長海，郭婧慧，程　昀，梁　蕾

(1. 遼寧醫學院航天中心醫院研究生培養基地超聲科，北京 100049；2. 遼寧醫學院航天中心醫院研究生培養基地病理科，北京 100049)

超聲彈性成像定量指標和半定量評分與乳腺腫瘤成纖維細胞分布的關聯性分析

劉焱1，郭君1，齊長海2，郭婧慧1，程昀1，梁蕾1

(1. 遼寧醫學院航天中心醫院研究生培養基地超聲科，北京 100049；2. 遼寧醫學院航天中心醫院研究生培養基地病理科，北京 100049)

目的:探討乳腺占位性病變超聲彈性成像定量指標和半定量評分與成纖維細胞分布的關聯性，闡明超聲彈性成像定量指標和半定量評分在乳腺腫瘤診斷中的價值。方法:對38例乳腺占位性病變進行超聲彈性成像檢查，并對彈性圖像進行定量分析，獲得11個特征量及相應的彈性應變率比值，進行半定量評分，根據病理結果將其分為良性組和惡性組,采用免疫組織化學法分別檢測乳腺間質穿膜糖蛋白(CD34)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達,分析成纖維細胞在乳腺病變中的分布特征,研究乳腺彈性成像定量評價指標和半定量評分與成纖維細胞分布的關聯性。結果:惡性組乳腺組織中CD34表達水平明顯低于良性組，而惡性組α-SMA表達水平明顯高于良性組，CD34和α-SMA在良性和惡性乳腺占位病變中表達水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。 惡性組彈性成像以藍色為主，良性組彈性成像以綠色為主，2組間彈性成像評分比較差異有統計學意義。CD34在乳腺腫瘤組織中的表達與彈性成像評分呈負相關關系(r=-0.423 7，P=0.027 3)，α-SMA在乳腺腫瘤組織中的表達與彈性成像評分呈正相關性關系(r=0.397 0，P=0.014 2)。CD34與11個特征量中應變均值及均等性、藍色區域百分比、峰度、偏度、雜亂度均有相關性(P<0.05)，其中與應變均值(r=0.385 6，P=0.016 8)及均等性(r=0.380 5，P=0.018 5)呈正相關關系，與藍色區域百分比(r=-0.351 7，P=0.030 4)、峰度(r=-0.427 7，P=0.007 4)、偏度(r=-0.394 6，P=0.014 2)、雜亂度(r=-0.344 3，P=0.034 3)、一致性(r=-0.484 9，P=0.002 0)及彈性應變率比值(r=-0.379 0，P=0.047 5)呈負相關關系，與標準偏差、復雜度、相關性和對比度無相關性(P>0.05)；而α-SMA與峰度(r=0.356 9，P=0.027 8)和偏度(r=0.323 0，P=0.047 9)、藍色區域百分比(r=0.382 0，P=0.021 6)以及彈性應變率比值(r=0.403 3，P=0.012 0)有相關性，并呈正相關關系。結論：超聲彈性成像定量指標和半定量評分與成纖維細胞在乳腺腫瘤中的分布具有相關性，有助于在術前通過無創手段初步判斷患者預后，可為乳腺癌的術前診斷、治療和手術時機選擇提供重要參考依據。

乳腺腫瘤；成纖維細胞；超聲彈性成像；組織彌散定量分析

2014年超聲彈性成像技術已被納入美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)乳腺癌指南，其通過乳腺腫瘤的彈性差異反映病變的硬度差異從而鑒別乳腺腫瘤的良惡性。成纖維細胞是乳腺間質的主要成分，乳腺癌間質肌成纖維細胞(myofibroblasts，MFS)增生程度決定腫瘤的硬度和上皮細胞的惡性行為。因此，MFS 與超聲彈性成像指標密切相關[1]。目前超聲彈性成像組織彌散定量分析技術多應用在評估慢性肝病嚴重程度方面，而在乳腺腫瘤方面的研究僅為半定量分析[2]。在乳腺腫瘤超聲彈性成像獲得組織彌散分析定量參數和半定量評價指標與MFS相關的分子病理學指標分析國內外尚無報道。本研究旨在初步分析乳腺腫瘤超聲彈性成像獲得的組織彌散分析定量參數和半定量評價指標與MFS相關的分子病理學指標——α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA) 及穿膜糖蛋白(CD34)之間的關聯性，探討11個特征量分布特征的關聯性，為乳腺癌的早期診斷及個體化靶向治療提供依據。

1　資料與方法

1.1研究對象收集2013年3月—2014年10月于本院就診的女性患者共38例，年齡21～76歲，平均(45.9±16.9)歲，所有病例均行超聲彈性成像檢查并獲得相應的定量參數指標。病灶最大徑為0.5～2.8 cm，平均(1.8±1.3)cm，為避免病灶過大而影響超聲彈性成像參數的準確性，病灶最大徑均小于3.0 cm。惡性腫瘤22例(惡性組)，其中浸潤性導管癌20例，原位癌1例，髓樣癌1例；非惡性腫瘤16例(良性組)，纖維腺瘤7例，腺病7例，導管內乳頭狀瘤1例，炎性病變1例。所有病灶均進行超聲引導下穿刺活檢或手術獲得病理結果。

1.2儀器與方法使用日本Hitachi公司HiVision 900彩色多普勒超聲診斷儀，探頭L-74 M，頻率5～13 MHz，儀器自帶彈性組織彌散定量分析軟件。首先行常規乳腺超聲檢查，觀察病灶位置、數目、大小、形態、內部回聲和血流情況等。根據病灶位置調整患者體位，盡可能使病灶保持水平位置，切換至彈性成像模式，彈性成像范圍包括病灶及其周圍組織，總面積約為病灶的3～4倍，應用實時顯示功能觀察灰階超聲圖與彈性圖，采用手動平穩微小抖動施壓，至獲得穩定、可重復的動態彈性圖，以1～5的數值實時顯示施壓程度，當壓力指示值為4時，方可評估檢查結果并認定其結果有效[2-3]，對病灶進行彈性評分后，通過軟件分析獲得組織彌散定量分析特征量，圖像存入超聲診斷儀，經2名經驗豐富的超聲科醫師分別對病灶圖像進行分析。乳腺彈性評分方法采用羅葆明改良評分標準[4]，根據彈性圖像中不同色彩的分布特征：1分，病灶整體或大部分顯示為綠色；2分，病灶顯示為中心呈藍色，周邊為綠色；3分，病灶范圍內顯示為綠色和藍色所占比例相近；4分，病灶整體為藍色或內部伴有少許綠色；5分，病灶及周邊組織均顯示為藍色，內部伴有或不伴有綠色。

1.3組織彌散定量參數的測量應用彈性組織彌散定量分析軟件對圖像進行分析，首先根據病灶的形狀采用橢圓形或多點描計的方法，盡可能包絡整個病灶，以獲得病灶區硬度與周圍同深度組織之間的彈性應變率(strain ratio)比值。然后選取不超出病灶范圍的最大矩形面積，測量3次,取平均值，得到病灶的11個組織彌散定量參數，包括應變均值(MEAN)、標準差(SD)、藍色區域面積(AREA%)、復雜度(COMP)、峰度(KURT)、偏度(SKEW)、對比度(CONT)、均等性(ENT)、雜亂度(IDM)、一致性(ASM)和相關性(CORR)。

1.4免疫組織化學法采用免疫組織化學Elivision法：CD34(克隆號QBEnd/10)、α-SMA(克隆號1A4)，抗體均為單克隆抗體，所用試劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。用已知陽性切片做陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。陽性結果判定： CD34,以細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性判定標準;α-SMA,細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性判定標準。陽性細胞分析：CD34和α-SMA結果判定采用雙評分半定量法進行評分。①顯色度按切片中細胞顯色有無及深淺記分:細胞無顯色記為0分，淺棕黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。② 光鏡下每張切片選取10個高倍(×400)視野，每個視野計數100個細胞，按陽性細胞所占百分比分為4個等級:陽性細胞<10%記為0分，10%～25%記為1分,26%～50%記為2分，>50%記為3分。將①+②得分相加，得0～1分為陰性表達(-)，2～3分為低度表達(+)，4～5分為中度表達()，6分為強度表達()。

1.5統計學分析采用SPSS 12.0統計軟件進行分析。采用正態性檢驗分析乳腺良、惡性病變彈性成像11個特征量是否符合正態性分布，正態分布數據采用t檢驗，非正態分布數據采用非參數U檢驗。乳腺良、惡性病變彈性評分的比較以及 CD34和α-SMA在乳腺良、惡性腫瘤組織中表達水平比較采用Willcox秩和檢驗；11個彈性特征量參數與 CD34和α-SMA的相關性采用Spearman相關性分析。檢驗水準α=0.05。

2　結　果

2.1超聲彈性評分惡性組超聲彈性成像以藍色為主，良性組超聲彈性成像以綠色為主，2組間彈性成像評分比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1乳腺良和惡性病變彈性評分

Tab.1Quantitative scores from ultrasound elastography of benign and malignant breast tumor

GroupQuantitativescore12345TotalBenign10420016Malignant02351222Total116551238

2.2CD34和α-SMA的定位及表達情況CD34在間質成纖維細胞中的表達：良性組中CD34蛋白主要定位于細胞質中， 13例良性病灶有不同程度的陽性表達，占81.8%(13/16)；乳腺導管原位癌導管周圍間質成纖維細胞數量明顯減少，偶見表達；所有浸潤性導管癌的間質中均缺乏CD34表達，周圍無癌細胞浸潤的正常區域可見CD34表達、其中3例為中度表達，占13.6%(3/22)。α-SMA在間質成纖維細胞中的表達：α-SMA蛋白在良性病灶成纖維細胞間質中不表達，主要定位于導管肌的上皮細胞中，而在惡性病灶的細胞間質中呈強陽性表達，導管肌上皮細胞表達缺失。7例纖維腺瘤間質成纖維細胞中α-SMA陰性表達6例，1例有輕度表達(+)，7例腺病中2例成纖維細胞α-SMA有輕度表達(+)，余良性病變為陰性表達；18例浸潤性導管癌間質中成纖維細胞有不同程度的α-SMA表達，陽性率為90%(18/20)，1例髓樣癌間質中成纖維細胞α-SMA為中度表達()，1例原位癌為陰性表達。CD34和α-SMA在乳腺良和惡性病灶中的表達比較差異有統計學意義(P=0.000)。見表2和圖1～4(封三)。

表2　CD34和α-SMA在乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達

2.3CD34和α-SMA表達與彈性成像評分相關性分析CD34表達和彈性成像評分呈負相關關系(r=-0.423 7，P=0.027 3)，α-SMA表達和彈性成像評分呈正相關關系(r=0.397 0，P=0.014 2)。

2.4CD34和α-SMA與乳腺腫瘤彈性成像組織彌散定量參數的關聯性分析 免疫組織化學指標CD34與11個特征量中應變均值及均等性、藍色區域百分比、峰度、偏度和雜亂度均有相關性(P<0.05)，其中與應變均值及均等性呈正相關關系，與藍色區域百分比、峰度、偏度、雜亂度和一致性呈負相關關系；與標準偏差、復雜度、相關性、對比度無相關性(P>0.05)，與彈性率比值呈負相關關系(r=-0.379 0，P=0.047 5)。 α-SMA與峰度(r=0.356 9，P=0.027 8)、偏度(r=0.323 0，P=0.047 9)、藍色區域百分比(r=0.382 0，P=0.021 6)及彈性應變率比值(r=0.403 3，P=0.012 0)均有相關性，與其他特征量均無相關性(P>0.05)。見表3。

3　討　論

過去對于乳腺腫瘤的研究主要集中在腫瘤的實質細胞，認為腫瘤是上皮基因和表型改變而導致的增殖結果[5]。近年來人們逐漸認識到腫瘤的生長、侵襲和轉移并不是腫瘤細胞獨立完成的，其中有趨化因子網絡體系對腫瘤細胞的協同作用[6]。在乳腺腫瘤的發生、發展過程中，腫瘤間質營造了利于腫瘤細胞生長的微環境。肌成纖維細胞，也稱MFS，是腫瘤間質的主要成分，MFS 的出現有助于對早期惡性病變做出診斷，也有助于良、惡性疾病的鑒

表3CD34與乳腺腫瘤彈性成像組織彌散定量參數的相關性

Tab.3Correlation between CD34 and characteristics from ultrasound elastography of breast tumor

CharacteristicCorrelationcoefficientPvalueMean0.38560.0168Standarddiviation0.10850.5167Arearatiooflow-strainregion-0.35170.0304Complexity0.01550.9266Kurtosis-0.42770.0074Skewness-0.39460.0142Contrast0.11010.5107Entropy0.38050.0185Inversedifferencemoment-0.34430.0343Angularsecondmoment-0.48490.0020Correlation-0.06070.7172

別診斷。本研究結果顯示：在良性病變中CD34蛋白不同程度地表達于MFS細胞質中，α-SMA蛋白主要定位于導管肌的上皮中；在惡性腫瘤中CD34蛋白主要定位于血管中，α-SMA主要定位于細胞質中。乳腺癌間質細胞中，CD34表達缺失，而α-SMA為大量表達；良性病變間質細胞中α-SMA表達缺失或輕度表達，而CD34有不同程度的表達。由此可見，通過CD34和α-SMA的表達情況可以判斷腫瘤中是否存在，從而判斷其在腫瘤中的分布特征，與徐繼等[7]對乳腺纖維間質成纖維細胞中α-SMA表達的研究結果相一致。在癌組織中MFS分布于腫瘤侵襲前沿、腫瘤-間質界面或腫瘤間質中靠近腫瘤血管內皮細胞并包繞著癌巢[1]。MFS對乳腺癌干細胞的表達具有正向調控作用，其增生程度又決定腫瘤的硬度。1991年Ophir等[8]提出彈性成像技術，隨后逐漸發展為一種實時成像的超聲技術，根據不同組織間彈性系數的差異，在受到外力壓迫后組織發生形變的程度不同而表現為相應的色彩來表示組織的硬度，目前在乳腺中的應用最為成熟，形成彈性成像中彈性差異的主要原因是腫瘤的硬度差異[9]。本組研究結果顯示：CD34的表達與彈性成像評分呈現負相關關系，α-SMA表達與彈性成像評分呈正相關關系。與郝軼等[1]報道結果一致。由此可見，在乳腺腫瘤中超聲彈性成像的評分越高，則表示α-SMA蛋白在乳腺腫瘤中表達越強，即超聲彈性成像的評分越高，則表示MFS在腫瘤中表達越強。因此，超聲彈性成像評分可以對MFS的分布情況進行初步判斷。

Hitachi公司開發的組織彌散定量分析軟件的核心為實時組織彈性成像的特征量提取和與組織彌散程度分級的組織分析[10]，通過對應變直方圖測算獲得的11個彈性圖像的特征量數據用多元回歸方程算出定量值，應用于組織彈性的定量研究，有學者[11]將此應用于評估慢性肝病嚴重程度的臨床應用研究，并發現其對無創區分慢性肝病各階段方面有較好的臨床價值。本研究將組織彌散定量分析軟件應用于乳腺腫瘤的測定，結果表明：11個特征量中應變均值及均等性、藍色區域百分比、峰度、偏度、雜亂度與免疫組織化學指標CD34均有相關性，其中與應變均值及均等性呈正相關關系，與藍色區域百分比、峰度、偏度、雜亂度、一致性和彈性率比值呈負相關關系，與標準偏差、復雜度、相關性、對比度無相關性；而α-SMA與特征量中的峰度、偏度、藍色區域百分比以及彈性應變率比值均有相關性，并呈正相關關系。與CD34和α-SMA共同具有相關性的特征量是峰度、偏度、藍色區域百分比、彈性率比值，并且相關性相反。彈性區域色彩應變率主要反應指標中的藍色區域百分比、彈性直方圖主要反應指標峰度和偏度以及彈性應變率比值越大，提示病變的硬度越高，CD34在乳腺腫瘤中表達越弱，α-SMA蛋白表達越強，MFS在乳腺腫瘤中表達越明顯[12-13]；而11個特征量中反應病灶均勻一致性的定量指標均等性、雜亂度、相關性、一致性與α-SMA無相關性。本研究結果提示：組織彌散定量分析軟件能夠從彈性成像定量的角度初步提示CD34和α-SMA的表達情況，峰度、偏度、藍色區域百分比以及彈性率比值作為敏感指標可提示MFS的分布情況，從而間接反映腫瘤良、惡性。

綜上所述，超聲彈性成像定量指標和半定量評分與乳腺腫瘤中成纖維細胞的分布具有相關性，鑒于間質成纖維細胞的生物學特性可反映病變性質及利于乳腺癌的鑒別診斷和病情判斷，超聲彈性成像定量參數和半定量評分以及分子病理學指標可為乳腺腫瘤提供更多有價值的鑒別診斷信息，有助于在術前通過無創手段初步判斷患者預后，為乳腺癌的術前診斷、治療及手術時機的選擇提供重要參考依據。但本研究的樣本量較小，有待進一步擴充樣本量深入研究。

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Analysis on correlation between quantitative results and semi-quantitative scores from ultrasound elastography and distribution of myofibroblasts in breast tumor

LIU Yan1,GUO Jun1,QI Changhai2,GUO Jinghui1,CHENG Yun1,LIANG Lei1

(1. Department of Ultrasound, Graduate Training Basement,Aerospace Central Hospital, Liaoning Medical University，Beijing 100049，China;2. Department of Pathology, Graduate Training Basement, Aerospace Central Hospital, Liaoning Medical University，Beijing 100049，China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the quantitative results, the semi-quantitative scores from ultrasound elastography and the distribution of myofibroblasts(MFS) in breast tumor,and to analyze the value of quantitative results and the semi-quantitative score from ultrasound elastography in the diagnosis of breast tumor.MethodsThirty eight patients with breast lesions underwent ultrasound elasticity examinations, tissue dispersion quantitative analysis technique was used to assess the 11 characteristic quantities and the corresponding strain ratios in all lesions,and the score of ultrasonic elastography was evaluated.38 cases were divided into benign and malignant group according to pathological diagnosis results.The expression levels of CD34 and α-SMA protein in breast tissue were examined by immunohistochemistry.The distribution patterns of MFS in breast tumor were analyzed.The correlation between the quantitative results, the semi-quantitative scores from ultrasound elastography and the distribution of MFS in breast tumor was studied．ResultsThe expression level of CD34 in malignant group was significantly higher than that in benign group，while the expression level of α-SMA was significantly higher than that in benign group;the differences in the expression levels of CD34 and α-SMA between benign and malignant breast tumor patients were statistically significant(P<0.01). The masses observed in malignant group by elastography were shown in blue，while most of the masses in benign group were shown in green.There were statistically significant differences between two groups in elastography scores(P<0.05).There was a anegative correlation between the CD34 expression in tumor tissue and the score of ultrasound elastography (r=-0.423 7，P=0.027 3).There was a negative correlation between the CD34 expression and the score of ultrasound elastography(r=-0.423 7，P=0.027 3)，while the positive correlation was found between the α-SMA expression and the score of ultrasound elastography(r=0.397 0，P=0.014 2).The CD34 expression was significantly correlated with the average relative strain value, entropy, area ratio of low-strain region, kurtosis, skewness and inverse difference moment (P<0.05).Among the 11 characteristics, CD34 was positively correlated with the average relative strain value(r=0.385 6，P=0.016 8) and entropy(r=0.380 5，P=0.018 5);CD34 was negatively correlated with area ratio of low-strain region(r=-0.351 7，P=0.030 4), kurtosis(r=-0.427 7，P=0.007 4), skewness(r=-0.394 6，P=0.014 2),inverse difference moment(r=-0.344 3，P=0.034 3), angular second moment(r=-0.484 9，P=0.002 0) and strain ration(r=-0.379 0，P=0.047 5);CD34 was not correlated with standard deviation, complexity and contrast(P>0.05). The α-SMA espression was positively correlated with kurtosis(r=0.356 9，P=0.027 8), skewness(r=0.323 0，P=0.047 9), area ratio of low-strain region(r=0.382 0，P=0.021 6)and strain ratio(r=0.403 3，P=0.012 0).ConclusionThe features and its scores of ultrasound elastography are correlated with the distribution of MFS in breast tumor, suggesting that the ultrasound elastography is very informative and helpful in the diagnosis of breast tumor.

breast neoplasms;fibroblasts;ultrasound elastography imaging; tissue dispersion quantitative analysis

1671-587Ⅹ(2015)06-1288-05

10.13481/j.1671-587x.20150637

2015-03-09

遼寧醫學院航天中心醫院院內項目資助課題(YN201406)

劉焱(1972-)， 女，吉林省長春市人，副主任醫師 ，在讀醫學碩士，主要從事乳腺腫瘤的診斷及介入超聲方面的研究。

郭君，主任醫師，碩士研究生導師(Tel:0431-59971519,E-mail:guojun0316@sohu.com)

R737.9

A